1、泡菜是我國(guó)歷史悠久且風(fēng)味獨(dú)特的一類冷加工蔬菜制品。目前我國(guó)的泡菜生產(chǎn)企業(yè)仍沿用自然發(fā)酵的傳統(tǒng)工藝,發(fā)酵菌種雜且未經(jīng)鑒定、發(fā)酵條件難控制、產(chǎn)品質(zhì)量難穩(wěn)定,存在一定食品安全隱患,這些問(wèn)題己嚴(yán)重制約了我國(guó)泡菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。鑒于目前泡菜生產(chǎn)中存在的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題,本文開(kāi)展了直投式發(fā)酵泡菜益生乳酸菌的選育和菌劑制備及其益生特性研究,研制出直投式泡菜發(fā)酵益生乳酸菌劑進(jìn)行泡菜發(fā)酵,既可解決我國(guó)泡菜產(chǎn)業(yè)中長(zhǎng)期存在的食品穩(wěn)定性和安全性問(wèn)題,又可生產(chǎn)出具有良好保健

2、功能的泡菜產(chǎn)品,達(dá)到高值高效轉(zhuǎn)化大宗蔬菜農(nóng)產(chǎn)品的目的。本研究可建立我國(guó)泡菜產(chǎn)業(yè)共性技術(shù)創(chuàng)新平臺(tái),扭轉(zhuǎn)我國(guó)發(fā)酵菌劑產(chǎn)品長(zhǎng)期依賴進(jìn)口的被動(dòng)局面,為我國(guó)的經(jīng)濟(jì)建設(shè)和解決“三農(nóng)”問(wèn)題做出重要貢獻(xiàn)。本文主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)論如下:
　　 1、研究了我國(guó)傳統(tǒng)泡菜發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌菌系變化及其消長(zhǎng)規(guī)律。結(jié)果顯示:腸膜明串珠菌腸膜亞種、糞腸球菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、植物乳桿菌、干酪乳桿菌和玉米乳桿菌主導(dǎo)整個(gè)泡菜發(fā)酵過(guò)程。腸膜明串珠菌腸膜亞種和糞腸球菌

3、在泡菜發(fā)酵初期(Od)即存在于泡菜發(fā)酵液中,而其它四種乳酸菌是在發(fā)酵過(guò)程中相繼出現(xiàn)。糞腸球菌和乳酸乳球菌乳酸亞種主要存在于泡菜發(fā)酵早期,在發(fā)酵中期就從泡菜發(fā)酵液中消失了。腸膜明串珠菌腸膜亞種到5d時(shí)從泡菜發(fā)酵液中消失了。玉米乳桿菌主要存在于泡菜發(fā)酵中期,到5.5d時(shí)泡菜發(fā)酵液中已檢測(cè)不到了。植物乳桿菌和干酪乳桿菌主要存在于泡菜發(fā)酵的中后期并完成整個(gè)發(fā)酵過(guò)程。研究結(jié)果闡明:腸膜明串珠菌是典型的異型乳酸發(fā)酵菌,啟動(dòng)整個(gè)泡菜發(fā)酵過(guò)程,其產(chǎn)生的

4、CO2為其他參與泡菜發(fā)酵的乳酸菌生長(zhǎng)提供了厭氧條件;隨后是糞腸球菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、玉米乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌等參與泡菜的中期發(fā)酵,大量產(chǎn)酸,是典型的同型乳酸發(fā)酵過(guò)程;最后由植物乳桿菌、干酪乳桿菌完成整個(gè)泡菜發(fā)酵過(guò)程。
　　 2、根據(jù)泡菜發(fā)酵菌系的研究結(jié)果,本研究設(shè)計(jì)目的培養(yǎng)基,從中國(guó)傳統(tǒng)泡菜老液中篩選出泡菜發(fā)酵性能優(yōu)良、能耐高濃度膽鹽和酸環(huán)境,能通過(guò)模擬人體胃屏障,順利到達(dá)腸道的功能性泡菜發(fā)酵專用菌株。通過(guò)泡菜發(fā)酵

5、性能測(cè)定,篩選出其中發(fā)酵性能最佳的編號(hào)NCU116菌株,經(jīng)生理生化、16S Rrna和pheS基因序列分析鑒定,確定該菌株為植物乳桿菌植物亞種(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)。
　　 3、應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌NCU116平衡培養(yǎng)基配方,利用中和法與指數(shù)流加法研究植物乳桿菌NCU116高密度培養(yǎng)條件。結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用SAS軟件進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基。優(yōu)

6、化后的平衡培養(yǎng)基配方為:葡萄糖5.43％、蛋白胨0.98%、K2HPO40.59%;研究植物乳桿菌NCU116高密度培養(yǎng)條件,利用15L全自動(dòng)發(fā)酵罐,在接種量3%、Ph6.5、培養(yǎng)溫度35℃的最佳條件下,采用氨水中和法和指數(shù)流加碳、氮源培養(yǎng)基,最終發(fā)酵液中植物乳桿菌NCU116菌體濃度達(dá)到9.3×10~CFU/Ml。
　　 4、采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選和優(yōu)化植物乳桿菌NCU116真空冷凍干燥的保護(hù)劑配方;研究了離心條件、

7、離心前發(fā)酵液Ph值、物料厚度和預(yù)冷凍時(shí)間等凍干條件對(duì)細(xì)胞活性的影響,測(cè)定了其共晶點(diǎn)、共熔點(diǎn)和崩解溫度,并研究了快速凍干和慢速凍干的效果,以及兩步法真空冷凍干燥技術(shù)條件。最終確定兩步法真空冷凍干燥技術(shù)參數(shù)為:保護(hù)劑5%海藻糖、10%脫脂奶粉和2%甘油;離心前發(fā)酵液Ph6.0,4000r/min離心15min,共晶點(diǎn)溫度為-31℃,共熔點(diǎn)溫度為-30.8℃,崩解溫度范圍為-32.9℃～-27℃,快速凍干效果高于慢速凍干,平皿中物料厚度4mm

8、,34℃真空干燥2h,-50℃下預(yù)冷凍2h,再真空冷凍干燥18h。兩步法真空冷凍干燥后樣品菌體濃度達(dá)9.8×1011CFU/g,含水率為0.61%,一步法真空冷凍干燥后樣品菌體濃度為5.8×1011CFU/g,含水率為1.94%,兩步法的凍干效果明顯高于一步法,具有良好的推廣應(yīng)用前景。
　　 5、以植物乳桿菌NCU116菌劑作為直投式發(fā)酵劑,研究傳統(tǒng)自然發(fā)酵泡菜與直投式發(fā)酵泡菜過(guò)程中Ph值、酸度以及腸道病原菌(大腸菌群、沙門氏菌

9、與金黃色葡萄球菌)的變化。結(jié)果表明,直投式發(fā)酵泡菜工藝可大幅度提高產(chǎn)酸速度和產(chǎn)酸能力,明顯加快泡菜發(fā)酵速度、縮短發(fā)酵時(shí)間;可顯著降低泡菜發(fā)酵過(guò)程中三種病原菌的數(shù)量(P＜0.05),使其數(shù)量一直處于較低水平,且在發(fā)酵的第2d消失,表明直投式發(fā)酵泡菜中植物乳桿菌NCU116對(duì)泡菜發(fā)酵過(guò)程中病原菌的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。
　　 6、模擬人體消化道環(huán)境,即在人工胃液、人工腸液、膽鹽和高鹽環(huán)境下對(duì)植物乳桿菌NCU116的耐受力進(jìn)行研究。

10、結(jié)果表明,植物乳桿菌NCU116在Ph1.5和Ph2.5的人工胃液中培養(yǎng)3h,存活率分別達(dá)到了32.62%和45.76%,在Ph值3.5以上的人工胃液中能保持很高的存活率;在人工腸液中作用4h,存活率達(dá)到了49.63%;在質(zhì)量濃度0.03～1.00g/100mL的牛膽鹽中培養(yǎng)24h后,活菌數(shù)隨牛膽鹽的增加而降低,但活菌數(shù)均保持在107CFU/ML以上;在質(zhì)量濃度1～8g/100mL的NaCl高鹽環(huán)境中培養(yǎng)24h后,活菌數(shù)隨NaCl的增加

11、而稍有降低,當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度達(dá)到8g/100mL時(shí),活菌數(shù)仍在108CFU/ML,以上。這表明植物乳桿菌NCU116對(duì)人工胃液、人工腸液、膽鹽和高鹽具有很好的耐受力,能在人體消化道中保持較好的存活率。在食品和保健品工業(yè)中具有良好的應(yīng)用前景。
　　 7、在人體腸道上皮細(xì)胞和粘膜表面的黏附性能是益生菌篩選的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。模擬人體腸道環(huán)境,采用體外細(xì)胞模型人體結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29考察植物乳桿菌NCU116的黏附性,并研究不同因素對(duì)

12、NCU116黏附HT-29的影響。結(jié)果顯示植物乳桿菌NCU116的黏附能力較強(qiáng),達(dá)到4.784±0.21 CFU/cell。黏附菌數(shù)隨菌體濃度升高而增加,當(dāng)菌體濃度達(dá)到1.0×108CFU/ML時(shí)趨于飽和。穩(wěn)定期的黏附效果較好,黏附數(shù)隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,到2.0h時(shí)逐漸趨于飽和。外部環(huán)境的Ph值對(duì)黏附性質(zhì)有很大影響,偏酸性環(huán)境更有利于黏附進(jìn)行。Ca2+、Mg2+對(duì)菌體與HT-29細(xì)胞的黏附作用沒(méi)有顯著影響。這表明植物乳桿菌NCU1

13、16在宿主體內(nèi)有較好的黏附性,在食品行業(yè)和保健業(yè)中具有良好的發(fā)展前景。
　　 8、以9種常見(jiàn)病原菌和非病原菌作為指示菌,采用牛津杯法對(duì)植物乳桿菌NCU116發(fā)酵液、菌體及代謝產(chǎn)物進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)。結(jié)果顯示NCU116對(duì)其中3株乳酸菌無(wú)抑制作用,對(duì)大腸埃希氏菌ATCC25922的抑制作用最強(qiáng)。進(jìn)一步研究了不同濃度樣品、不同有機(jī)酸、排除有機(jī)酸及過(guò)氧化氫干擾以及經(jīng)Ph調(diào)節(jié)、熱處理、酶處理后NCU116對(duì)大腸埃希氏菌ATCC25922的