1、目前,食品安全問題已成為我國繼人口、資源、環(huán)境之后的第四大社會問題。在所有食品安全問題中,由致病菌或條件致病菌的污染引起的食品安全事件又占有相當大的比重。在這些致病菌中由致病性大腸埃希氏菌引起的食品安全問題尤其值得人們關注。從肆虐全球30年可引起腹瀉、出血性腸炎等疾病的大腸埃希氏菌O157︰H7到近期出現在德國的大腸埃希氏菌O104︰H4疫情,所有這些由致病性大腸埃希氏菌引發(fā)的公共衛(wèi)生事件造成了嚴重的人員及財產損失并引發(fā)了全球的高度關注

2、。
　　因此,建立一種可以對不同地理來源的大腸埃希氏菌進行有效追溯的方法將對于控制食源性感染、追溯食品中致病性大腸埃希氏菌來源將起到重要作用。目前,大腸埃希氏菌溯源研究主要集中在寄主溯源,并且多種分子生物學技術運用于該領域的研究中。與其他分子溯源技術相比,MLST技術以其流程標準化,結果易于驗證,重復性好,數據便于通過互聯(lián)網共享等特點在多種細菌來源追溯研究中被廣泛使用。但是MLST技術依靠大量基因測序,不適用于大量樣本的溯源檢測。

3、
　　而SNP檢測技術使用簡單、便捷、低成本的方法就可以獲得可靠結果。因此,基于大腸埃希氏菌持家基因SNP溯源分析技術逐漸成為新興熱點。但是SNP技術在大腸埃希氏菌地理來源追溯方面的研究仍是空白。
　　本研究首次將SNP技術應用于大腸埃希氏菌的地理溯源研究。
　　本研究簡述如下:
　　1.大腸埃希氏菌持家基因的選擇。根據文獻報道結合自行軟件計算基因多態(tài)性值,選擇大腸埃希氏菌四個持家基因clpX(caseinoly

4、tic peptidase X,酪蛋白水解蛋白酶X),fadD(acyl-CoA synthetase,?；o酶A合成酶),mdh(蘋果酸脫氫酶),uidA(beta-glucuronidase,葡萄糖苷酸酶)作為研究的目標基因。
　　2.持家基因中多態(tài)性位點的篩選。以大腸埃希氏菌多位點序列分型數據庫(MLSTDatabase)數據為基礎,采用生物學軟件Minimum SNPs計算四個持家基因中能夠反映位點分辨力的辛普森系數(即D

5、值)、選擇D值大于0.86并結合文獻報道及人工序列比對選擇候選位點。共獲得12個SNP位點。
　　3.不同地理來源大腸埃希氏菌菌株收集。從進口生畜肉及加工食品及食品原料中分離大腸埃希氏菌菌株。生畜肉來自四大洲,12個國家和地區(qū):歐洲的丹麥(63株),德國(20株),愛爾蘭(17株),法國(17株),西班牙(25株);北美洲的美國(24株),加拿大(20株);大洋洲的澳大利亞(9株),新西蘭(3株);亞洲的印度(45株),中國(6株

6、)以及中國臺灣(4株)。共253株。菌株經鑒定純化后使用。
　　4.通過測序,獲得每株菌持家基因上的SNP位點。具體步驟為:確定大腸埃希氏菌四個持家基因測序引物,對四個持家基因分別進行PCR擴增、測序,生物信息學方法對多態(tài)性位點進行人工篩查分析,根據得到的多態(tài)性信息聚類分析。253株大腸埃希氏菌被聚為61個SNP Groups。在9個SNP Groups,菌株表現出按大洲聚集的現象:SNP Group5,SNP Group19,S

7、NP Group39,SNP Group42,SNP Group43,SNP Group55中全部菌株來源于歐洲;SNP Group59中全部菌株來源于大洋洲;SNP Group52中全部菌株來源于北美洲;SNP Group22中全部菌株來源于亞洲。對于菌株數小于等于2株的SNPGroups,得到了35個地理特異性SNP標記。其他SNPGroup中菌株來源于不同大洲或不同國家,說明大腸埃希氏菌分離株具有豐富的遺傳多樣性。
　　5.

8、用10株隱藏來源的大腸埃希氏菌分離株進行盲樣測試,以驗證所得到的地理標記。盲樣測試結果顯示:10株分離菌中,按照洲際溯源準確率為80％;按照國家溯源準確率為60%。
　　6.本研究嘗試應用大腸埃希氏菌較保守的持家基因中的一定數量的SNP位點組合對大腸埃希氏菌地理來源進行追溯,結果顯示SNP具備大腸埃希氏菌地理來源追溯的能力。
　　7.eBURST分析與SNP分析在分離株群體遺傳進化方面具有相關性,與SNP分析相比eBURST