蛋清溶菌酶稀釋復(fù)性過程中集聚體和中間態(tài)的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本文以溶菌酶為模型蛋白研究了蛋白質(zhì)的復(fù)性機理。用熒光相圖法研究了蛋清溶菌酶稀釋復(fù)性過程的中間態(tài),用陰極聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和高效凝膠排阻層析法(SEC)研究了蛋清溶菌酶稀釋復(fù)性過程形成的集聚體。本研究結(jié)果為探索蛋白質(zhì)折疊機理提供了有益的幫助。 在用熒光相圖法研究脲和鹽酸胍誘導(dǎo)去折疊蛋清溶菌酶的折疊過程中發(fā)現(xiàn):當去折疊體系中有還原劑β-巰基乙醇時,還原變性溶菌酶的稀

2、釋復(fù)性過程中都沒有中間態(tài)產(chǎn)生,符合典型的“二態(tài)模型”;當去折疊體系中沒有還原劑存在時,變性溶菌酶的稀釋復(fù)性過程中都會產(chǎn)生兩個中間態(tài),符合“四態(tài)模型”。 當用復(fù)性緩沖液稀釋還原脲變性溶菌酶時,會迅速產(chǎn)生可觀量的沉淀。上清液和沉淀的非還原SDS-PAGE結(jié)果表明還原脲變性溶菌酶除了能直接復(fù)性成天然態(tài)溶菌酶分子外,還能在上清液中形成溶菌酶分子三聚體,同時在沉淀中形成溶菌酶分子二聚體。上清液的SEC分析結(jié)果也驗證了上清液中含有溶菌酶分子

3、三聚體。上清液和沉淀的還原SDS-PAGE結(jié)果表明,二聚體和三聚體主要是還原脲變性溶菌酶分子通過分子間二硫鍵錯配形成的。同時沉淀的陰極PAGE電泳和在復(fù)性過程中加入SDS的復(fù)性結(jié)果表明復(fù)性過程中形成的二聚體是可溶的,可溶的溶菌酶分子二聚體之間通過非共價鍵相互作用形成了溶菌酶分子四聚體沉淀。 非還原脲變性溶菌酶稀釋復(fù)性液的非還原SDS-PAGE結(jié)果表明當溶菌酶濃度小于7.0mg/mL時,復(fù)性過程中不會形成集聚體;而當溶菌酶濃度大于

4、7.0mg/mL時,復(fù)性過程中會形成溶菌酶分子二聚體和三聚體。復(fù)性液的陰極PAGE表明,當溶菌酶濃度小于4.0mg/mL時,復(fù)性過程中不會形成集聚體;而當溶菌酶濃度大于4.0mg/mL時,復(fù)性過程中會形成溶菌酶分子二聚體和三聚體。同時,復(fù)性液的SEC結(jié)果也證實了非還原脲變性蛋清溶菌酶在復(fù)性過程中產(chǎn)生了溶菌酶分子二聚體和三聚體。 綜合以上實驗結(jié)果可以得出以下結(jié)論:(Ⅰ)還原脲和鹽酸胍變性溶菌酶的稀釋復(fù)性過程中沒有中間態(tài)產(chǎn)生,它們的

5、復(fù)性過程均為“二態(tài)過程”。還原脲變性溶菌酶的稀釋復(fù)性過程為:還原脲變性溶菌酶分子通過分子間二硫鍵錯配形成可溶的溶菌酶分子二聚體和三聚體,然后可溶的二聚體之間以非共價鍵相互作用形成四聚體沉淀。(Ⅱ)非還原脲和鹽酸胍變性溶菌酶的稀釋復(fù)性過程中都產(chǎn)生兩個中間態(tài),它們的復(fù)性過程均為“四態(tài)過程”。非還原脲變性溶菌酶的稀釋復(fù)性過程為:當溶菌酶濃度小于4.0mg/mL時,復(fù)性過程中不形成集聚體;當溶菌酶濃度為4.0~7.0mg/mL時,中間態(tài)會由于分

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