1、中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(mesencephalicastrocyte-derivedneurotrophicfactor,MANF)是一種分泌性蛋白,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmicreticulumstress,ERstress)情況下可上調(diào)表達(dá),對(duì)缺血的心、腦具有保護(hù)作用,并對(duì)體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用,且具有抑制炎癥的作用,但MANF的具體作用機(jī)制仍不明確。我們通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)篩選人胚胎腦cDNA文庫(kù),尋找

2、與MANF相互作用蛋白,為進(jìn)一步研究MANF的功能機(jī)制奠定基礎(chǔ)。通過(guò)酵母雙雜交篩選出7個(gè)與MANF相互作用的蛋白,RNF2蛋白是其中之一。RNF2是Polycombgroup(PcG)家族的成員,過(guò)表達(dá)同屬PcG家族的SCMH1或BMI1蛋白可減輕缺血耐受大鼠的神經(jīng)損傷,并且RNF2在缺血耐受大鼠腦和視網(wǎng)膜中表達(dá)上調(diào),據(jù)此我們推測(cè)RNF2可能也具有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MANF和RNF2的相互作用,在大鼠腦缺血再灌注

3、的模型中觀察RNF2和MANF在缺血皮層中的表達(dá)及共定位情況,并觀察過(guò)表達(dá)或沉默RNF2對(duì)體外誘導(dǎo)ER應(yīng)激的神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響,以證實(shí)RNF2與MANF的相互作用及其神經(jīng)保護(hù)作用。
　　目的:
　　1、篩選與MANF相互作用的蛋白;
　　2、驗(yàn)證RNF2與MANF的相互作用;
　　3、觀察RNF2的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　方法:
　　用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與MANF相互作用的蛋白,結(jié)果篩選出7個(gè)與MANF相

4、互作用的蛋白,RNF2就是其中之一。再分別用酵母共轉(zhuǎn)、體外Pulldown、免疫共沉淀、細(xì)胞免疫熒光、核漿分離等方法驗(yàn)證RNF2和MANF的相互作用;線栓法制作SD大鼠腦缺血再灌注(MCAO)模型,采用免疫熒光雙標(biāo)方法檢測(cè)RNF2和MANF在MCAO模型大鼠腦組織皮質(zhì)部位的表達(dá)和定位情況;用tunicamycin(TM)處理N2A細(xì)胞,誘導(dǎo)ER應(yīng)激,過(guò)表達(dá)或沉默RNF2后,用免疫印跡法檢測(cè)CHOP和激活的caspase-3的表達(dá)水平,并

5、用PI染色觀察細(xì)胞死亡情況。
　　結(jié)果:
　　1.用酵母雙雜交方法篩選與MANF相互作用的蛋白
　　1.1誘餌質(zhì)粒pGBKT7-MANF的毒性及自激活效應(yīng)檢測(cè)
　　構(gòu)建酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒pGBKT7-MANF,分別將空載體pGBKT7和誘餌質(zhì)粒pGBKT7-MANF小規(guī)模轉(zhuǎn)化酵母Gold菌,待長(zhǎng)出較密克隆后,分別挑取直徑相同的GoldpGBKT7和GoldpGBKT7-MANF,在3ml的YPDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)

6、夜后,600nm的吸光度分別為1.25和1.24,表明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-MANF對(duì)酵母沒(méi)有毒性,不影響酵母的正常生長(zhǎng)。GoldpGBKT7-MANF在SD/-His/-Trp營(yíng)養(yǎng)缺陷板上不生長(zhǎng),在SD/-Trp/X-α-gal平板上長(zhǎng)出白色菌落,說(shuō)明pGBKT7-MANF沒(méi)有自身報(bào)告基因激活的能力。
　　1.2檢測(cè)bait陽(yáng)性酵母克隆中MANF融合蛋白的表達(dá)
　　為了進(jìn)一步確定酵母轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性克隆中確實(shí)表達(dá)MANF的融合蛋

7、白,我們用IB的方法檢測(cè)了酵母裂解液中的MANF蛋白。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)化空載體pGBKT7的酵母表達(dá)分子量約25KD的載體蛋白。與對(duì)照相比,轉(zhuǎn)化pGBKT7-MANF的酵母蛋白樣品中所檢測(cè)到的融合蛋白分子量約為45kd,與預(yù)期相符。說(shuō)明pGBKT7-MANF在酵母中可以表達(dá)。
　　1.3酵母融合與陽(yáng)性克隆的篩選
　　將轉(zhuǎn)化了誘餌質(zhì)粒的酵母與轉(zhuǎn)化了人胚胎腦文庫(kù)的酵母菌株共同孵育結(jié)合,在倒置顯微鏡下觀察到大量三葉草狀二倍體細(xì)胞時(shí)終止

8、孵育。然后將菌液涂布于60塊TDO平板上篩選出180個(gè)陽(yáng)性克隆。挑取直徑大的克隆,點(diǎn)在QDO/X平板上,篩選出17個(gè)變藍(lán)的克隆。從QDO/X平板上挑取深藍(lán)色克隆,反復(fù)3次劃線于DDO/X平板上,去掉2個(gè)假陽(yáng)性克隆,再將DDO/X平板上篩選所得的所有純藍(lán)色陽(yáng)性克隆反復(fù)3次劃線于QDO/X平板上,得到15個(gè)純藍(lán)色的陽(yáng)性克隆。
　　1.4基因序列的測(cè)定與分析
　　將篩選出的15個(gè)陽(yáng)性酵母克隆做菌落PCR,排除掉PCR產(chǎn)物大小一致的

9、克隆。提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化大腸桿菌后提取質(zhì)粒,進(jìn)一步經(jīng)核苷酸序列測(cè)定,并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較,發(fā)現(xiàn)7個(gè)與人MANF相互作用的蛋白,RNF2蛋白為其中之一。
　　2.酵母回復(fù)性雜交驗(yàn)證RNF2和MANF的相互作用
　　將RNF2全長(zhǎng)編碼序列構(gòu)建到pGADT7載體上,將pGBKT7-MANF和pGADT7-RNF2共轉(zhuǎn)化到酵母Gold菌株進(jìn)行回復(fù)性雜交。結(jié)果顯示:共轉(zhuǎn)化后的酵母可以在營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基QDO/X上正

10、常生長(zhǎng)并呈現(xiàn)藍(lán)色,提示在酵母中RNF2確實(shí)能與MANF相互作用。
　　3.GSTpull-down證明RNF2和MANF有直接的相互作用
　　為進(jìn)一步明確在酵母體系中篩選出的RNF2和MANF相互作用,我們表達(dá)并純化GST-RNF2蛋白和MANF-his蛋白。將純化的兩種蛋白混合后進(jìn)行GSTpull-down實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,RNF2能與MANF特異性的結(jié)合,證明RNF2和MANF有直接的相互作用。
　　4.免疫共沉淀證

11、實(shí)MANF與RNF2相互作用
　　為了進(jìn)一步研究MANF與RNF2是否在真核細(xì)胞內(nèi)相互作用,我們建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP-MANF的細(xì)胞系N2A-MANF,用RNF2抗體沉淀穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系N2A-MANF中的RNF2蛋白,再用GFP抗體檢測(cè)免疫沉淀物中是否含有MANF。結(jié)果表明,在真核細(xì)胞內(nèi)RNF2可以與MANF相互作用。
　　5.ER應(yīng)激誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞中的MANF入核,與RNF2相互作用
　　5.1ER應(yīng)激誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞中的

12、MANF與RNF2共定位于細(xì)胞核
　　本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn),ER應(yīng)激可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞中MANF的核轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究中我們想了解是否MANF與RNF2在神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)可以相互作用。我們用tunicamycin(4μg/ml)刺激N2A細(xì)胞,16hrs后收集細(xì)胞做免疫熒光染色,觀察MANF和RNF2的共定位情況。結(jié)果顯示,未經(jīng)tunicamycin刺激的N2A中,RNF2蛋白為細(xì)胞核定位的蛋白,而MANF蛋白主要分布于胞漿。經(jīng)tunica

13、mycin刺激后,MANF在細(xì)胞核內(nèi)的含量明顯增多,并與RNF2共定位。
　　5.2免疫共沉淀證實(shí)MANF與RNF2在細(xì)胞核內(nèi)相互作用
　　在N2A細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MANF-FLAG質(zhì)粒,用tunicamycin(4μg/ml)刺激N2A細(xì)胞,16hrs后收集細(xì)胞分離細(xì)胞核和細(xì)胞漿蛋白,用FLAG抗體分別沉淀胞漿和胞核的MANF蛋白,IB檢測(cè)免疫沉淀物中是否含有RNF2。結(jié)果表明,RNF2和MANF在細(xì)胞核內(nèi)相互作用,且在ER應(yīng)激

14、下相互作用明顯增強(qiáng)。
　　6.ER應(yīng)激誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞中RNF2的表達(dá)
　　為了觀察ER應(yīng)激狀態(tài)下RNF2的表達(dá)情況,我們?cè)贜2A中給予ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑tunicamycin(4μg/ml)處理16hrs,IB檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)MANF和RNF2的表達(dá)都顯著上調(diào)。說(shuō)明ER應(yīng)激同樣能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞中RNF2的表達(dá)。
　　7.輕度腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞中的RNF2表達(dá)及其與MANF的共定位
　　為了觀察RNF2在大鼠腦缺血再

15、灌注損傷的大腦皮層中的表達(dá)情況和與MANF的共定位情況,我們用線栓法制作SD大鼠腦缺血再灌注模型,用免疫熒光雙標(biāo)方法觀察MANF和RNF2的表達(dá)和定位情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在缺血再灌注24hrs的大腦皮層中,RNF2和MANF的表達(dá)均上調(diào),且共定位。而在缺血再灌注48hrs后,皮層水腫嚴(yán)重,RNF2和MANF幾乎不表達(dá),提示輕度腦缺血再灌注損傷可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞中RNF2和MANF的表達(dá)。
　　8.RNF2knockdown并驗(yàn)證

16、　　應(yīng)用RNAi技術(shù)對(duì)N2A細(xì)胞中內(nèi)源性的RNF2進(jìn)行敲低。轉(zhuǎn)染RNF2-siRNA后分別于24hrs,48hrs,36hrs和72hrs收取細(xì)胞,提取蛋白檢測(cè)RNF2蛋白質(zhì)水平的變化。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染36hrs~48hrsRNF2的沉默效率最高。
　　9.RNF2可以減少ER應(yīng)激介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的死亡
　　在N2A細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RNF2的過(guò)表達(dá)質(zhì)?；騭iRNA,經(jīng)TM處理16hrs或不經(jīng)TM處理后進(jìn)行PI染色,并對(duì)染色陽(yáng)性細(xì)胞

17、進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TM處理的實(shí)驗(yàn)組中,過(guò)表達(dá)RNF2能減少PI染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù),沉默內(nèi)源性的RNF2能明顯增加PI染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù),提示RNF2可以抑制ER應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
　　10.RNF2通過(guò)抑制caspases-3的活化減少ER應(yīng)激介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的凋亡
　　我們?cè)贜2A細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RNF2的過(guò)表達(dá)質(zhì)?；騭iRNA,經(jīng)TM處理16hrs或不經(jīng)TM處理,IB檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)TM處理后CHOP和激活的caspase-