1、本研究分為三部分：
　　 第一部分、大鼠肝星狀細胞的原代分離，培養(yǎng)，鑒定
　　 目的:改進大鼠肝星狀細胞的分離培養(yǎng)方法，提高細胞的得率、活力和純度。
　　 方法：采用離體膠原酶灌注消化與蛋白酶E 消化相結(jié)合的方法，通過25[％]percoll連續(xù)密度梯度離心，分離純化肝星狀細胞，并通過臺盼藍拒染實驗，觀察其形態(tài)和免疫熒光檢測desmin表達測定其純度、活力。
　　 結(jié)果：每只大鼠可獲得肝星狀細胞1.3±0

2、.2×107個，細胞活率為(94±3)[％]，細胞活得率高于原有方法，通過免疫熒光檢測細胞純度為(97±2)[％]。
　　 結(jié)論：本方法簡單、使用、效果優(yōu)于原有方法。
　　 第二部分、肝星狀細胞誘導(dǎo)卵圓細胞分化為成熟肝細胞
　　 目的：研究肝星狀細胞在體外培養(yǎng)的卵圓細胞系LE6細胞向成熟肝細胞分化過程中的作用。
　　 材料與方法：(1)將LE6細胞分別與原代培養(yǎng)的肝星狀細胞混合共培養(yǎng)(co-mix)、采用

3、millicell小室不接觸共培養(yǎng)(co-sep)，LE6細胞單獨培養(yǎng)作為對照；分第1周、第2周、第3周作為三個時間點觀測，采用western blotting和realtime-PCR檢測肝細胞分化標志物和卵圓細胞標志物肝細胞核因子4 α(hepatocyte nuclearfactor-4 α，HNF-4 α)、白蛋白、甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)、細胞角蛋白19(cytokeratin-19，CK-19)的

4、表達量；(2)電子透射顯微鏡觀察LE6細胞超微結(jié)構(gòu)的變化(3)periodic acid-schiff(PAS)染色檢測各時間點LE6細胞內(nèi)糖原顆粒的含量。(4)ELISA檢測各時間點LE6細胞分泌白蛋白的含量。
　　 結(jié)果：(1)隨著共培養(yǎng)時間的延長，LE6細胞表達肝細胞標志物HNF-4 α和白蛋白的量逐漸增加，明顯高于對照組，且混合共培養(yǎng)組的表達量明顯高于不接觸共培養(yǎng)組(P<0.01)；而LE6細胞標志物AFP、CK-19的

5、表達量則逐漸降低，且混合共培養(yǎng)組的表達量明顯低于不接觸共培養(yǎng)組(P<0.01)。(2)LE6細胞共培養(yǎng)后白蛋白分泌量明顯增加，且混合共培養(yǎng)組高于不接觸共培養(yǎng)組(P<0.01)。(3)
　　 隨著共培養(yǎng)時間的延長，LE6細胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基體等細胞器逐漸豐富，且細胞間形成毛細膽管結(jié)構(gòu)。(4)PAS 糖原染色顯示共培養(yǎng)后LE6細胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅色糖原顆粒。
　　 結(jié)論：肝星狀細胞可以誘導(dǎo)LE6細胞向成熟肝細胞分化。肝星

6、狀細胞除了通過細胞因子等可溶性因子途徑發(fā)揮作用外，與LE6細胞的直接接觸也有著重要作用。
　　 第三部分、肝星狀細胞對卵圓細胞增殖的調(diào)控作用
　　 目的：研究在AAF/PH 卵圓細胞增殖模型中，肝切除后不同時間點肝星狀細胞對卵圓細胞增殖的調(diào)控作用。
　　 方法：將實驗大鼠隨機分為兩組：(1)肝切除組：大鼠建立AAF/PH 卵圓細胞增殖模型。(2)對照組：大鼠接受AAF處理，但不進行肝切除，代之假手術(shù)。在70[％]

7、肝切除術(shù)或假手術(shù)后的不同時間點提取肝星狀細胞，收集原代肝星狀細胞條件培養(yǎng)液，通過MTT、PCNA 標記以及流式細胞術(shù)檢測肝星狀細胞條件培養(yǎng)液對卵圓細胞系LE6細胞增殖、凋亡的影響。并通過ELISA檢測肝星狀細胞條件培養(yǎng)液中HGF、TGF-β、IL-10的含量，并通過相應(yīng)阻斷劑阻斷其作用，證實上述細胞因子對LE6細胞增殖凋亡的作用。
　　 結(jié)果：相對于肝切除前，經(jīng)肝切除后2、3 天提取肝星狀細胞條件培養(yǎng)液處理的LE6細胞PCNA

8、標記率下降為為40.5±2.0[％]和25.3±5.3[％]，相對細胞數(shù)下降為0.668±0.128和0.388±0.104；6、9 天提取的肝星狀細胞條件培養(yǎng)液處理的LE6細胞的PCNA 標記率上升為62.3±3.2[％]和85.4±4.3[％]，相對細胞數(shù)上升為：1.641±0.182和1.868±0.225；12，15天提取的肝星狀細胞條件培養(yǎng)液處理的LE6細胞的PCNA 標記率下降為44.9±2.9[％]和44.2±2.8[％]

9、，相對細胞數(shù)下降為1.038±0.033和0.875±0.048；而LE6細胞凋亡的變化趨勢和PCNA 標記率及相對細胞數(shù)變化趨勢相反。IL-10中和抗體、HGF 受體抑制劑PHA665752,TGF-β拮抗劑SB-431542可以阻斷不同時間點肝星狀細胞條件培養(yǎng)液對卵圓細胞增殖分化的影響。
　　 結(jié)論：在AAF/PH 卵圓細胞增值模型中，卵圓細胞介導(dǎo)的肝再生的不同階段肝星狀細胞分泌不同種類和不同量的細胞因子，并通過這些細胞因子