1、目的:
　　構建靶向Nrf2基因的siRNA真核表達重組載體,轉染H9c2心肌樣細胞,利用缺氧/復氧(H/R)損傷模型及缺氧預適應(HPC)延遲保護模型,從Nrf2-ARE信號通路的角度,探討 HPC上調抗氧化酶(HO-1、MnSOD)介導心肌細胞延遲保護的新途徑。
　　方法:
　　1.利用siRNA真核表達載體pGPU6/GFP/Neo,設計并構建靶向Nrf2的RNA干擾重組質粒pGPU6/GFP/Neo-Nrf2

2、siRNA,同時設計并構建陰性對照RNA干擾重組載體,用于鑒定pGPU6/GFP/Neo質粒介導的RNA干擾體系的特異性;
　　2.通過Western Blot法分別檢測H9c2心肌樣細胞經(jīng)HPC處理后0、12、24、48、72 h各時間點的Nrf2核轉位變化;并在Nrf2核轉位最顯著的時間點,應用染色質免疫共沉淀(ChIP)法檢測胞核內Nrf2與HO-1及MnSOD基因啟動子區(qū)內抗氧化反應元件(ARE)結合的變化;
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3、. H9c2細胞經(jīng) pGPU6/GFP/Neo-Nrf2 siRNA重組載體或陰性對照載體pGPU6/GFP/Neo-NC siRNA瞬時轉染24 h后,建立HPC延遲保護模型。實驗處理后,通過Western Blot法分別檢測核內Nrf2蛋白表達以及胞內HO-1、MnSOD蛋白表達的變化;
　　4. H9c2細胞經(jīng) pGPU6/GFP/Neo-Nrf2 siRNA重組載體或陰性對照載體pGPU6/GFP/Neo-NC siRNA

4、瞬時轉染24 h后,分別建立H/R損傷及HPC延遲保護模型。實驗處理后,MTT法檢測各實驗組心肌細胞存活率;根據(jù)試劑盒說明分別檢測各組細胞內LDH的漏出量,應用比色法測定MDA含量以及SOD、CAT、GPx等抗氧化物酶的活性;流式細胞術檢測細胞內活性氧(ROS)含量的變化。
　　結果:
　　1.經(jīng)基因測序證實,成功構建了 Nrf2 siRNA真核表達重組質粒pGPU6/GFP/Neo-Nrf2 siRNA及陰性對照載體pGP

5、U6/GFP/Neo-NC siRNA。此外,經(jīng)Western blot檢測證實該質粒瞬時轉染H9c2細胞24 h后,胞內Nrf2蛋白表達顯著下調。
　　2. H9c2心肌樣細胞經(jīng)HPC處理后12 h,Nrf2核轉位開始增加,HPC后24 h達到峰值,而HPC后72 h回到基礎水平。可見,HPC誘導Nrf2核轉位變化與HPC延遲保護出現(xiàn)的時間窗相一致;同時,ChIP法證實HPC后24 h,Nrf2在胞核內與HO-1及MnSOD基因

6、啟動子區(qū)內ARE的結合均明顯增加。
　　3. H9c2心肌樣細胞經(jīng)HPC處理后24 h,核內Nrf2蛋白表達及胞內抗氧化酶HO-1、MnSOD的蛋白表達水平顯著增加,與相應的Control組比較均有顯著性差異(p<0.01)。然而,預先瞬時轉染Nrf2 siRNA表達載體后,HPC上述效應被逆轉。
　　4. H9c2心肌樣細胞經(jīng)HPC處理后24 h,可顯著提高H/R損傷心肌細胞的生存率,抑制LDH的活性;并能顯著減少H9c2

7、心肌細胞H/R過程中所產(chǎn)生的活性氧,同時增加內源性抗氧化酶(SOD,GPx,CAT)活性,并減少MDA的生成,在細胞水平上進一步證明了HPC能對抗H/R所誘發(fā)的氧化應激,產(chǎn)生延遲保護作用。然而,預先瞬時轉染Nrf2 siRNA表達載體后,HPC上述效應均被逆轉。
　　結論:
　　1.成功構建了Nrf2 siRNA真核表達重組質粒pGPU6/GFP/Neo-Nrf2 siRNA,為進一步研究Nrf2信號通路在HPC心肌延遲保護