1、研究背景：
　　 慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是常見的惡性血液疾病，費城染色體和Bcr-Abl融合基因的形成在其發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。伊馬替尼(Imatinib)是CML特異性的分子靶向藥物。雖然伊馬替尼對部分CML患者（尤其是慢性期患者）具有很好的療效，但伴隨應(yīng)用的積累和疾病的進(jìn)展，仍然不可避免會出現(xiàn)伊馬替尼耐藥現(xiàn)象。研究表明伊馬替尼的耐藥除了Bcr-Abl相關(guān)的機(jī)制外，還與其他信

2、號傳導(dǎo)通路如NF-κB等信號通路的激活、多藥耐藥基因異常表達(dá)等因素相關(guān)。
　　 CUEDC2(CUE domain-containing2)是個新近報道的功能研究尚較少的蛋白，其特征是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有一個中度保守的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)-CUE結(jié)構(gòu)域，參與泛素蛋白酶體途徑，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的泛素化與降解。研究發(fā)現(xiàn)CUEDC2除了在細(xì)胞周期、NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)等生理過程中均能發(fā)揮重要作用，而且在乳腺癌、卵巢癌、腎癌等多種實體腫瘤中發(fā)現(xiàn)存

3、在高表達(dá);并且在乳腺癌中通過參與雌激素受體ER-α的泛素化降解過程影響乳腺癌的內(nèi)分泌治療敏感性。目前的研究已證實NF-κB作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子在CML中處于異常活化狀態(tài)，在CML發(fā)生發(fā)展及耐藥等過程中均發(fā)揮重要的作用，但CUEDC2在CML中的表達(dá)情況和功能還未見報道，CUEDC2是否也參與了CML的發(fā)生、發(fā)展和耐藥過程，以及其在CML中的作用機(jī)制是否和NF-κB信號通路相關(guān)，需要進(jìn)一步研究探索。
　　 目的：
　　 檢

4、測CUEDC2在CML患者骨髓標(biāo)本及CML細(xì)胞系中的表達(dá)情況;以K562和耐伊馬替尼的K562細(xì)胞K562/G01為研究對象，探究CUEDC2在CML細(xì)胞伊馬替尼耐藥中的作用及相關(guān)作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.收集2011年8月～2012年8月本院收治的58例CML患者及10例正常對照骨髓標(biāo)本，分離單個核細(xì)胞，應(yīng)用實時定量PCR方法檢測骨髓單個核細(xì)胞中CUEDC2基因的表達(dá)水平。
　　 2.應(yīng)用實時定量PC

5、R方法檢測CML細(xì)胞系K562及耐伊馬替尼的K562細(xì)胞系K562/G01中CUEDC2的表達(dá)水平。
　　 3.利用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建靶向CUEDC2的特異性干擾載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞（CUEDC2高表達(dá)CML細(xì)胞系），下調(diào)細(xì)胞內(nèi)的CUEDC2表達(dá)水平。采用MTT實驗檢測CUEDC2沉默對K562細(xì)胞生長增殖活性的影響，利用Hoechst染色、Annexin V-APC/PI雙染及Western blot方法檢測CUEDC

6、2沉默對伊馬替尼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力的影響。
　　 4.利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建CUEDC2-pIRES2表達(dá)質(zhì)粒，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染K562/G01細(xì)胞（CUEDC2低表達(dá)的CML細(xì)胞系），使其過表達(dá)CUEDC2。采用MTT實驗檢測過表達(dá)CUEDC2對K562/G01細(xì)胞生長增殖活性的影響，利用Hoechst染色、Annexin V-APC/PI雙染及Western blot檢測過表達(dá)CUEDC2對伊馬替尼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力的影響。
　　

7、 5.Western Blot方法檢測上述干擾或過表達(dá)細(xì)胞及相應(yīng)對照細(xì)胞中的NF-κB信號通路相關(guān)蛋白IKKα、IKKβ、IκBα的表達(dá)水平及IκBα、IKKα/β磷酸化水平的變化。免疫熒光法觀察細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65蛋白核定位的情況，判斷其入核活化狀態(tài)。
　　 結(jié)果：
　　 1.58例CML患者中CUEDC2的表達(dá)水平明顯高于正常對照組，CUEDC2表達(dá)水平與CML患者年齡、性別無關(guān)，而與臨床分期相關(guān);慢性期患者骨

8、髓細(xì)胞中CUEDC2的表達(dá)水平顯著高于進(jìn)展期(AP和BC期)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.在CML細(xì)胞系K562細(xì)胞中CUEDC2mRNA的表達(dá)水平明顯高于正常對照組(P＜0.05); K562細(xì)胞中的CUEDC2mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯高于其耐伊馬替尼細(xì)胞系K562/G01(P＜0.05)。
　　 3.成功建立了利用shRNA干擾技術(shù)導(dǎo)致CUEDC2沉默的穩(wěn)定K562細(xì)胞系K562-sh1及K

9、562-sh2。MTT實驗結(jié)果顯示CUEDC2沉默不影響K562細(xì)胞的生長增殖活性。凋亡實驗結(jié)果顯示CUEDC2沉默的K562-sh1、K562-sh2細(xì)胞在伊馬替尼處理后凋亡細(xì)胞比例較對照細(xì)胞組(K562-NC)明顯下降，凋亡效應(yīng)蛋白caspase-3的剪切活化形式較對照組細(xì)胞明顯減少，表明CUEDC2沉默降低了K562細(xì)胞對伊馬替尼的敏感性。
　　 4.成功構(gòu)建了CUEDC2過表達(dá)質(zhì)粒，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染K562/G01細(xì)胞。MTT

10、實驗結(jié)果顯示過表達(dá)CUEDC2對K562/G01細(xì)胞的生長增殖活性無明顯影響。藥物誘導(dǎo)的凋亡實驗結(jié)果顯示過表達(dá)CUEDC2的K562/G01經(jīng)伊馬替尼處理后凋亡細(xì)胞比例較對照組細(xì)胞明顯上升，caspase-3的剪切活化形式較對照組細(xì)胞明顯增加，表明CUEDC2過表達(dá)增強(qiáng)了K562/G01對伊馬替尼的敏感性。
　　 5.對比K562和K562/G01細(xì)胞中NF-κB信號通路活性，發(fā)現(xiàn)K562細(xì)胞中IKKα/β和IκBα蛋白的磷酸化

11、水平較K562/G01低，NF-κB在K562細(xì)胞核中的定位也較K562/G01減少，IKKα、IKKβ的表達(dá)未見明顯差異，結(jié)果提示K562/G01細(xì)胞中NF-κB信號通路的組成性活性強(qiáng)于K562細(xì)胞。
　　 6.檢測CUEDC2沉默的K562細(xì)胞中的NF-κB信號通路活性的結(jié)果顯示，K562-sh1/sh2細(xì)胞中IKKα/β和IκBα蛋白的磷酸化水平較對照細(xì)胞明顯增高，NF-κB在細(xì)胞核內(nèi)的的定位較對照細(xì)胞明顯增加，而IKKα

12、、IKKβ的表達(dá)和對照相比未見明顯變化，表明CUEDC2沉默后K562細(xì)胞中NF-κB信號通路活性增強(qiáng);且當(dāng)CUEDC2沉默的K562細(xì)胞經(jīng)NF-κB特異性抑制劑Bay11-7082(IκB磷酸化抑制劑)處理后，IκBα的磷酸化水平降低，NF-κB在細(xì)胞核內(nèi)的定位減少，NF-κB信號通路活性降低，對伊馬替尼的敏感性增加。
　　 7.檢測CUEDC2過表達(dá)的K562/G01細(xì)胞中的NF-κB信號通路活性的結(jié)果顯示，過表達(dá)CUEDC

13、2使K562/G01細(xì)胞內(nèi)的IKKα/β和IκBα蛋白的磷酸化水平較對照組細(xì)胞降低，NF-κB在細(xì)胞核內(nèi)的定位也較對照組細(xì)胞減少，IKKα、IKKβ的表達(dá)無明顯變化，表明過表達(dá)CUEDC2降低了K562/G01細(xì)胞中的NF-κB信號通路活性。
　　 結(jié)論：
　　 1.CML患者骨髓標(biāo)本以及CML細(xì)胞系K562中存在CUEDC2的高表達(dá)，且CUEDC2的表達(dá)水平與CML患者臨床分期有關(guān)，CUEDC2在慢性期CML患者中的表

14、達(dá)水平明顯高于進(jìn)展期，此外，CUEDC2在敏感CML細(xì)胞系K562中的表達(dá)水平也顯著高于伊馬替尼耐藥細(xì)胞系K562/G01。我們的上述研究結(jié)果首次明確了CML患者及細(xì)胞系中的CUEDC2表達(dá)情況，并且提示CUEDC2可能參與了CML的發(fā)生、發(fā)展以及伊馬替尼耐藥過程。
　　 2.CUEDC2表達(dá)能夠負(fù)調(diào)控CML細(xì)胞的伊馬替尼耐藥水平，在CUEDC2高表達(dá)的K562中下調(diào)CUEDC2表達(dá)能夠增加K562細(xì)胞對伊馬替尼的耐藥能力，而在