1、目的：
　　1、用免疫抑制劑CsA處理BALB/c小鼠,抑制小鼠的免疫功能。再以這些動(dòng)物為對象,尾靜脈高壓水注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒,監(jiān)測小鼠的病毒血癥、抗原血癥和抗體反應(yīng),探討免疫抑制劑CsA對HBV復(fù)制過程的影響。
　　2、觀察CsA不同處理時(shí)間對HBV復(fù)制小鼠的病毒復(fù)制和抗原表達(dá)的影響;同時(shí)檢測各組小鼠天然免疫和獲得性免疫反應(yīng),探討免疫抑制影響HBV復(fù)制的機(jī)制。
　　3、用CsA長期處理建立HBV慢性復(fù)制的

2、BALB/c小鼠模型,在停止CsA處理后分別對HBV復(fù)制慢性化的小鼠予以主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫,探討免疫調(diào)節(jié)對免疫抑制狀態(tài)下HBV持續(xù)復(fù)制的影響。
　　材料和方法：
　　1、6-8周齡的雌性BALB/c小鼠,購自湖北省疾病控制中心。
　　2、分別用NS或CsA處理BALB/c小鼠,用質(zhì)粒pAAV/HBV1.2經(jīng)尾靜脈高壓水注射小鼠,建立HBV復(fù)制的小鼠模型。定期采集小鼠血液樣本,ECLIA檢測血清內(nèi)HBsAg、HBsAb、

3、HBcAb的水平,同時(shí)抽提血清內(nèi)的HBV DNA,Real-Time PCR檢測血清內(nèi)的病毒滴度。分析CsA處理對HBV復(fù)制過程的影響。
　　3、將BALB/c小鼠分為CsA短期處理(-1至4周)組、CsA持續(xù)處理(-1至10周)組以及生理鹽水處理組,在不同的時(shí)間點(diǎn)采集血液樣本或處死小鼠,Elispot檢測小鼠脾臟分泌IFN-γ的HBcAg特異性T細(xì)胞頻率。Real-Time PCR檢測小鼠肝組織和脾組織內(nèi)CD分子和抗病毒相關(guān)的細(xì)

4、胞因子的mRNA水平。Southern Blot檢測肝內(nèi)HBV的復(fù)制中間體。免疫組化檢測肝組織內(nèi)HBcAg的表達(dá)水平。分析CsA處理延長HBV復(fù)制的免疫學(xué)機(jī)制。
　　4、用CsA處理BALB/c小鼠(-1至10周),在0周尾靜脈高壓水注射質(zhì)粒pAAV/HBV1.2建立HBV復(fù)制的小鼠模型。在終止CsA處理后2周后分別給予小鼠PBS、重組乙肝疫苗、未免疫小鼠脾細(xì)胞過繼免疫和特異性免疫小鼠脾細(xì)胞過繼免疫處理,探討免疫調(diào)節(jié)對免疫抑制狀態(tài)

5、下HBV持續(xù)復(fù)制的影響。
　　結(jié)果：
　　1、將質(zhì)粒pAAV/HBV1.2通過尾靜脈高壓水注射到BALB/c小鼠體內(nèi),能使小鼠產(chǎn)生較高的抗原血癥和病毒血癥。NS處理組7周內(nèi)HBsAg被清除。CsA處理組在CsA處理期間抗原血癥和病毒血癥均維持在較高的水平。用CsA處理11周(-1至10周),能使75％的動(dòng)物 HBsAg的持續(xù)陽性超過6個(gè)月。
　　2、隨著CsA處理時(shí)間的延長,小鼠HBsAg的表達(dá)持續(xù)時(shí)間也相應(yīng)延長。Cs

6、A處理7周(-1至6周),能使大部分動(dòng)物HBsAg持續(xù)陽性達(dá)6個(gè)月以上。
　　3、CsA持續(xù)處理不能抑制小鼠特異性T細(xì)胞的產(chǎn)生。相反,CsA處理組特異性T細(xì)胞反應(yīng)較NS處理組明顯增強(qiáng)。
　　4、CsA處理能抑制某些CD分子和細(xì)胞因子在肝組織和脾組織內(nèi)的表達(dá),包括CD3、CD4、CD8、FasL、Perforin、IL-2。但是對IFN-γ、TNF-α和IFN-β的表達(dá)卻沒有影響。CsA短期處理后,HBV感染清除,部分細(xì)胞因子

7、的表達(dá)呈反彈上升趨勢。
　　5、停止CsA處理的慢性HBV復(fù)制小鼠中,重組乙肝疫苗治療能促進(jìn)HBV的清除,并促進(jìn)HBsAb和HBcAb的產(chǎn)生,增強(qiáng)小鼠特異性T細(xì)胞應(yīng)答。
　　6、停止CsA處理的慢性HBV復(fù)制小鼠中,特異性免疫小鼠脾細(xì)胞過繼免疫和未免疫小鼠脾細(xì)胞過繼免疫均能控制HBV的復(fù)制,其中特異性免疫小鼠脾細(xì)胞過繼免疫的作用尤為明顯,并能促進(jìn)HBcAb的產(chǎn)生和增強(qiáng)小鼠特異性T細(xì)胞應(yīng)答。
　　結(jié)論：
　　1、在

8、高壓水注射小鼠模型中,用CsA處理BALB/c小鼠能改變HBV復(fù)制持續(xù)的時(shí)間。CsA持續(xù)處理7周(-1至6周)可有效延長 HBV的復(fù)制時(shí)間至6個(gè)月以上。
　　2、CsA處理對特異性 T細(xì)胞的產(chǎn)生,以及相應(yīng)細(xì)胞IFN-γ和TNF-α的表達(dá)和分泌無明細(xì)影響,但是對Perforin和Fas-L等免疫分子表達(dá)有抑制作用,與HBV的持續(xù)復(fù)制有關(guān)。這提示 HBV的清除需要機(jī)體具備完整的免疫功能,功能缺失的特異性T細(xì)胞不足以清除HBV感染。

9、r>　　3、隨著CsA處理的終止,CsA短期處理的小鼠體內(nèi)HBV的復(fù)制可被清除,肝內(nèi)和脾內(nèi)多種CD分子和細(xì)胞因子的表達(dá)水平反彈上升,特異性T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力也增強(qiáng),提示短期免疫抑制劑處理后機(jī)體的免疫功能可逐漸恢復(fù)并控制HBV的復(fù)制。
　　4、在停止CsA處理的HBV持續(xù)性復(fù)制小鼠中,重組乙肝疫苗免疫或特異性脾細(xì)胞過繼免疫能有效清除或控制HBV的復(fù)制,促進(jìn)小鼠體液免疫應(yīng)答的恢復(fù),增強(qiáng)特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　本研究的

10、創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1、以高壓水注射的急性HBV復(fù)制小鼠模型為背景,利用免疫抑制劑處理BALB/c小鼠,導(dǎo)致HBV的持續(xù)復(fù)制。并初步闡述了CsA對宿主免疫功能的抑制作用,以及對延長HBV復(fù)制的可能免疫學(xué)機(jī)制。
　　2、利用CsA處理的HBV持續(xù)性復(fù)制小鼠模型,探討免疫調(diào)節(jié)治療在控制HBV感染中的作用。重組乙肝疫苗主動(dòng)免疫或特異性脾細(xì)胞過繼免疫能清除后有效控制HBV的復(fù)制,促進(jìn)體液免疫應(yīng)答的恢復(fù),并促進(jìn)特異性T細(xì)胞應(yīng)答的增強(qiáng),提示免