1、目的：研究惡性黑色素瘤組織中線形程序性壞死(linearly patterned programmed cell necrosis,LPPCN)的分布及其形態(tài)學(xué)特點(diǎn),并探討其臨床病理意義。初步分析LPPCN發(fā)生的相關(guān)分子機(jī)制及其與血管生成擬態(tài)(Vasculongenic mimicry,VM)和內(nèi)皮依賴性血管(Endothelium dependent vessel,EDV)形成的相關(guān)性。
　　 方法：
　　 1.應(yīng)用形

2、態(tài)學(xué)分析方法觀察惡性黑色素瘤中LPPCN的存在及其分布特點(diǎn),并探討其臨床病理意義。
　　 自1996-2007年天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院存檔石蠟標(biāo)本中,挑選出經(jīng)手術(shù)切除的、病理論斷明確且隨訪資料完整的惡性黑色素瘤標(biāo)本共70例,每例標(biāo)本均進(jìn)行HE切片后由有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師核實(shí)臨床病理論斷,進(jìn)一步觀察LPPCN的形態(tài)特點(diǎn)并分析LPPCN的分布和臨床病理意義。
　　 2.采用免疫組織化學(xué)方法初步分析黑色素瘤中LPPCN的發(fā)生機(jī)制

3、及其與血管新生的相關(guān)性。
　　 檢測(cè)黑色素瘤組織中Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(ClassⅢPI3K)的表達(dá)情況,分析LPPCN與自噬的相關(guān)性。檢測(cè)組織中基質(zhì)金屬蛋白酶2、9(Matrixmetalloproteinase2、9,MMP2、MMP9)、金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP-1)、組織蛋白酶D(CathepsinD,CathD)、CD105、TGFβ1、p-paxillin、Ⅷ因子相關(guān)抗原(Ⅷ-RAg)及D2-40等蛋白的

4、表達(dá)情況,同時(shí)進(jìn)行CD31/PAS雙重染色計(jì)數(shù)血管生成擬態(tài)密度(Vasculogenicmimicrydensity,VMD),從而分析LPPCN與VM、內(nèi)皮依賴性血管及淋巴管形成的相關(guān)性。
　　 3.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timePCR)檢測(cè)LPPCN陽(yáng)性組與陰性組中相關(guān)基因mRNA的表達(dá)差異,分析它們與LPPCN的關(guān)系。
　　 收集天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院組織庫(kù)2005年至今新鮮凍存標(biāo)本黑色素瘤組織30例

5、,通過冰凍切片HE染色觀察其中是否存在LPPCN,將其分為L(zhǎng)PPCN陽(yáng)性組與LPPCN陰性組。利用Real-timePCR檢測(cè)兩組中目的基因ClassⅢPI3K、TGFβ1的表達(dá)差異,從mRNA的水平分析LPPCN的發(fā)生機(jī)制及其與血管生成的相關(guān)性。
　　 結(jié)果
　　 1.黑色素瘤中LPPCN的形態(tài)學(xué)分布特點(diǎn)及其臨床病理意義黑色素瘤標(biāo)本中LPPCN陽(yáng)性率為54.29％(38/70),LPPCN在HE鏡下形態(tài)為一簇胞質(zhì)濃縮、

6、胞核深染的腫瘤細(xì)胞,呈線形或網(wǎng)狀分布。LPPCN陽(yáng)性率在不同的腫瘤大小、核分裂像數(shù)目及breslow厚度之間差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而與性別、年齡、部位、有無瘤栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無關(guān)?；颊叩纳媛试贚PPCN陽(yáng)性組低于陰性組(P=0.046)。
　　 2.免疫組化染色結(jié)果分析在黑色素瘤組織中,LPPCN陽(yáng)性組ClassⅢPI3K、CD105標(biāo)記的微血管密度(microvesseldensity,MVD)、TGFβ1、

7、Ⅷ-RAg-MVD、VMD及MMP2表達(dá)高于LPPCN陰性組,差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而D2-40標(biāo)記的微淋巴管密度(lymphvesseldensity,LVD)、MMP9、CathD在兩組間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；ClassⅢPI3K、TGFβ1在發(fā)生LPPCN的腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)高于周圍的腫瘤細(xì)胞,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CD105與TGFβ1的表達(dá)呈正相關(guān)；CD105-MVD、Ⅷ-RAg-M

8、VD及VMD均與LPPCN的密度呈正相關(guān)。p-paxillin在黑色素瘤組織中呈普遍低或無表達(dá),也可見其在部分血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。
　　 VM陽(yáng)性組MMP2、MMP9表達(dá)高于VM陰性組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且TIMP-1在VM陽(yáng)性組的表達(dá)低于VM陰性組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CathD在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示D2-40標(biāo)記的LVD在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組高于陰性組,差別

9、均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.Real-timePCR結(jié)果分析Real-timePCR結(jié)果顯示,在惡性黑色素瘤組織中,LPPCN陽(yáng)性組中ClassⅢPI3K、TGFβ1mRNA表達(dá)均高于LPPCN陰性組,與免疫組化結(jié)果趨勢(shì)一致,但僅TGFβ1mRNA表達(dá)量在兩組間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.惡性黑色素瘤中存在LPPCN及VM,具有LPPCN及VM的患者預(yù)后差。