1、少突膠質(zhì)前體細胞(Oligodendrocyteprecursorcells,OPCs)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem,CNS)中存在并廣泛分布的一類膠質(zhì)細胞,它可以分化成熟為少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞,其遷移活動對CNS的發(fā)育、損傷修復(fù)與功能重建,以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病如多發(fā)性硬化(multiplesclerosis,MS)等的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮著非常重要的作用。近年來的研究認為CNS損傷修復(fù)過程中神經(jīng)纖維的

2、脫髓鞘反應(yīng)以及髓鞘的修復(fù)與再生障礙是制約神經(jīng)損傷修復(fù)結(jié)局與功能重建的重要原因,而成功的髓鞘修復(fù)與再生則極有可能成為改善這一困難局面的重要環(huán)節(jié)。因此,研究髓鞘的形成機制與相關(guān)的調(diào)節(jié)因素成為CNS損傷修復(fù)研究領(lǐng)域的熱點問題。眾所周知,CNS髓鞘的形成在胚胎時期主要是由少突膠質(zhì)細胞完成,然而在機體成熟以后,少突膠質(zhì)細胞是否具有修復(fù)與再生髓鞘的能力尚無確切的結(jié)論。近來的研究發(fā)現(xiàn),由OPCs分化形成的少突膠質(zhì)細胞(Oligodendrocyte,

3、OL)具有再生和形成髓鞘的能力。體外實驗發(fā)現(xiàn),將OPCs與胚胎脊髓共組織培養(yǎng),OPCs能夠分化形成OL并為新生的神經(jīng)纖維形成髓鞘;在脊髓損傷的研究中發(fā)現(xiàn),OPCs能夠從脊髓的腹側(cè)遷移到背側(cè),部分細胞能在損傷灶周圍分化形成OL;同樣,在對MS的研究中也發(fā)現(xiàn),脫髓鞘病灶的周圍有大量NG2染色陽性的OPCs,進一步的研究發(fā)現(xiàn),這些NG2陽性細胞主要是從室管膜下區(qū)遷移而來;這些研究都有力的提示OPCs的確參與了CNS損傷與修復(fù)的過程,并且很可能

4、在這個過程中扮演了十分重要的角色。為此,研究OPCs的發(fā)育成熟規(guī)律、遷移機制以及相關(guān)因素成為闡明上述問題的重要內(nèi)容。
　　眾所周知,細胞的遷移不僅取決于細胞本身的特性,而且受眾多環(huán)境因素的影響,如細胞基質(zhì)蛋白、層粘連蛋白等,環(huán)境中的離子含量變化、甚至pH變化也可能對細胞的遷移產(chǎn)生影響。近年來尤其引人關(guān)注的是各種細胞因子對細胞遷移的作用。因為,環(huán)境因素可以通過多種措施加以控制和調(diào)節(jié),并能在特定的條件下得到穩(wěn)定,而細胞因子通常需要與特

5、定的細胞受體結(jié)合,并通過一系列的細胞內(nèi)過程才能實現(xiàn),作用的機制更加復(fù)雜而多變;更為重要的是,細胞因子的遷移誘導(dǎo)作用具有定向性,信號過程的傳遞、濃度梯度的變化等均可以造成細胞的定向遷移。課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn),軸突誘導(dǎo)因子Semaphorins家族成員不僅對再生軸突的生長具有誘導(dǎo)作用,而且對OPCs的遷移也有誘導(dǎo)作用。陳煥然博士的研究發(fā)現(xiàn)Semaphorins家族成員Sema3A對OPCs遷移具有誘導(dǎo)作用,其作用機制與RhoG信號通路相

6、關(guān)分子的變化有關(guān);而對軸突定向延伸作用更明顯的Sema3F是否也有類似的作用?尚無相關(guān)的文獻報道。新近的研究發(fā)現(xiàn)sema3與多種腫瘤細胞的遷移有關(guān),而此誘導(dǎo)遷移的功能的實現(xiàn)需要與其受體分子NRP2/plexinA3復(fù)合體共同參與,方能激活相應(yīng)的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)鏈,從而誘導(dǎo)細胞遷移。既然PlexinA3及神經(jīng)菌毛素2(neuropilin2,NRP2)作為sema3F的特異性受體,介導(dǎo)sema3F的在多種細胞內(nèi)信號傳導(dǎo),在細胞的遷移活動中發(fā)

7、揮重要的調(diào)節(jié)作用,Sema3F對OPCs是否也具有類似的誘導(dǎo)作用?其作用是否同樣是通過NRP2/plexinA3介導(dǎo),以上問題尚未見類似報道。作者在前期預(yù)實驗中通過Transwell遷移倉實驗研究發(fā)現(xiàn),Sema3F的確對OPCs的定向遷移具有誘導(dǎo)作用。如果能夠在OPCs上發(fā)現(xiàn)plexinA3及其NRP2的表達,無疑對解釋上述現(xiàn)象并認識OPCs的遷移機制具有重要意義。因此,我們設(shè)計實驗對以上問題進行了研究:首先于體外分離培養(yǎng)及純化OPCs

8、,并誘導(dǎo)其向成熟少突膠質(zhì)細胞分化,通過RT-PCR、Westernblot、免疫組化、免疫熒光染色等手段,研究plexinA3在OPCs不同分化階段上的表達與特點;其次,在此基礎(chǔ)上,通過分子生物學手段調(diào)控plexinA3在OPCs中的表達,觀察plexinA3表達變化對Sema3F誘導(dǎo)OPCs遷移的影響,最后從上述研究結(jié)果中,闡明plexinA3在Sema3F誘導(dǎo)OPCs遷移中的作用,為深入研究OPCs定向遷移的機制奠定實驗基礎(chǔ)。研究結(jié)

9、果如下:
　　第一部分(第二章內(nèi)容):PlexinA3在OPCs不同分化階段的表達
　　采用振蕩分離法體外分離培養(yǎng)新生大鼠OPCs,并觀察了bFGF及PDGF-AA誘導(dǎo)OPCs增殖與分化的作用,采用NG2、O4及MBP抗體檢測OPCs不同分化階段細胞的表達;在此基礎(chǔ)上,通過RT-PCR,Westernblot、免疫熒光雙標檢測并分析plexinA3及NRP2在OPCs不同分化階段細胞中的表達與特點,主要結(jié)果如下:
　　

10、1.振蕩分離法分離新生大鼠OPCs,方法簡單、穩(wěn)定、可靠,獲得的OPCs純度高,通過二次接種培養(yǎng)即可達到滿足實驗所需純度及數(shù)量的OPCs;bFGF及PDGF-AA能誘導(dǎo)OPCs的增殖與分化,NG2,O4及MBP免疫組化染色可識別到OPCs不同分化的細胞階段;
　　2.在OPCs階段,即(NG2+染色陽性階段)及未成熟階段(即O4+染色陽性階段),plexinA3高表達,當OPCs分化成熟為OL后(即MBP+染色陽性階段)其表達明顯

11、下調(diào)。作為協(xié)同受體的NRP2在OPCs分化過程中的表達特點與plexinA3類似;但從Westernblot及RT-PCR等方法的檢測結(jié)果觀察,在OPCs各分化階段,NRP2的表達水平較plexinA3稍高,推測可能與其具有結(jié)合多種協(xié)同受體的特殊功能有關(guān);
　　3.PlexinA3及NRP2均主要表達于OPCs及未成熟的少突膠質(zhì)細胞的細胞膜及突起上,提示二者可能OPCs的誘導(dǎo)遷移有關(guān)。
　　第二部分(第三章內(nèi)容):plexi

12、nA3對sema3F誘導(dǎo)OPCs遷移的影響
　　第一部分研究證實plexinA3及NRP2表達在OPCs的細胞膜及細胞突起上,并均出現(xiàn)在OPCs階段及未成熟階段,故推測其可能參與了Sema3F介導(dǎo)的OPCs遷移的調(diào)控。為此,本部分實驗擬通過siRNA干擾技術(shù)調(diào)節(jié)plexinA3及NRP2在OPCs中的表達水平,通過干擾其表達后觀察Sema3F誘導(dǎo)OPCs遷移的改變,從而證實plexinA3在sema3F誘導(dǎo)OPCs遷移中的作用。首

13、先分別設(shè)計了plexinA3及NRP2的siRNA,利用MTT實驗檢測plexinA3siRNA及NRP2siRNA對OPCs生存能力的影響,確認其無細胞毒性后,采用RT-PCR技術(shù)分別檢測兩種siRNA的干擾效果,達到實驗要求后,利用脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染技術(shù),將plexinA3siRNA及NRP2siRNA分別轉(zhuǎn)染OPCs,通過Transwell遷移倉實驗,比較下調(diào)plexinA3及NRP2表達后,sema3F誘導(dǎo)OPCs遷移的變化,藉

14、此闡明plexinA3及NRP2在OPCs遷移中的作用。主要實驗結(jié)果如下:
　　1.MTT試驗結(jié)果證實,使用合成的plexinA3siRNA及NRP2siRNA濃度在0.125~2.00μg/μl范圍內(nèi)對OPCs沒有明顯的細胞毒性作用;
　　2.脂質(zhì)體介導(dǎo)plexinA3siRNA及NRP2siRNA轉(zhuǎn)染OPCs后,通過TR-PCR檢測,二者能分別有效地抑制OPCs表達plexinA3及NRP2,其抑制效率可達64~79％;

15、
　　3.Trenswell遷移倉實驗證實Sema3F對OPCs具有誘導(dǎo)遷移作用,加入plexinA3siRNA后,OPCs的遷移率明顯降低,加入NRP2siRNA后,OPCs的遷移率下降更加明顯,兩者相比具有統(tǒng)計學差異,提示NRP2-siRNA的抑制效果更加明顯。
　　以上結(jié)果說明,sema3F對于OPCs具有誘導(dǎo)遷移作用,plexinA3及NRP2作為sema3F誘導(dǎo)作用的協(xié)同受體共同參與了其對OPCs遷移過程的調(diào)控,相