1、第一部分 目的: 采用簡易的方法制備早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病的可量化動(dòng)物模型。 方法: 新生鼠仔44只稱重隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組于出生后7d置于75±1％氧箱內(nèi)飼養(yǎng)5d后回到正常空氣飼養(yǎng)5d,對照組于常氧環(huán)境飼養(yǎng)。視網(wǎng)膜鋪片(ADP酶法)了解視網(wǎng)膜血管的改變，組織切片HE染色計(jì)數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)，免疫組化法觀察視網(wǎng)膜各層血管內(nèi)皮生長因子(WEGF)的表達(dá)。 結(jié)果: 持續(xù)高濃度氧使鼠仔視網(wǎng)膜血管收縮變窄甚至閉

2、塞，視網(wǎng)膜中央部大片無灌溉區(qū)，相對缺氧使視網(wǎng)膜大血管明顯擴(kuò)張、迂曲，大量結(jié)構(gòu)異常的新生血管形成。實(shí)驗(yàn)組與對照組平均每個(gè)切面突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)分別為33.85±0.7452；2.60±0.6806。兩者比較差異有顯著性意義(P＜0.01)；對照組VEGF染色較實(shí)驗(yàn)組減弱。 結(jié)論: 該模型可重復(fù)性強(qiáng)，穩(wěn)定性高，可定量研究。是研究ROP新生血管發(fā)生機(jī)制及相關(guān)治療的合適模型。 第二部分 目的: 測定正常鼠及R

3、OP時(shí)視網(wǎng)膜缺氧誘導(dǎo)因1α(HIF-1α僅)和VEGF的表達(dá)及其對血管新生的調(diào)控作用，為闡明ROP的發(fā)病機(jī)制提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 新生Wistar鼠仔64只稱重隨機(jī)均分為兩組，實(shí)驗(yàn)組于出生后7d置于75±1％氧箱內(nèi)飼養(yǎng)5d后回到正?？諝怙曫B(yǎng)5d，對照組于常氧環(huán)境飼養(yǎng)。HE染色計(jì)數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)；免疫組化法觀察視網(wǎng)膜各層VEGF和HIF-1α的表達(dá)及三者相關(guān)性。 結(jié)果: 實(shí)驗(yàn)組，對照組平均每個(gè)切面

4、突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)分別為32.80±0.7678；2.75±0.7164，兩者比較差異有顯著性(P＜0.01)；免疫組化結(jié)果顯示：對照組：VEGF在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中有少許表達(dá)，HIF-1α無表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組：VEGF在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿和胞核中表達(dá)明顯增加，HIF-1α在胞核中有表達(dá)。視網(wǎng)膜新生血管芽細(xì)胞核數(shù)與視網(wǎng)膜組織VEGF含量和HEF-1α含量均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.791，p＜0.01；r=0.951，

5、p＜0.01.視網(wǎng)膜組織中HIF-1α與VEGF含量呈正相關(guān)(r=0.99,p＜0.01). 結(jié)論: 視網(wǎng)膜局部缺氧，導(dǎo)致HIF-1α表達(dá)，VEGF表達(dá)增加，新生血管異常發(fā)育，出現(xiàn)ROP的病理改變，突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核明顯增加，三者呈正相關(guān)。 目的: 建立成功的ROP模型，玻璃體腔注射HIF-1α反義寡核苷酸了解其對視網(wǎng)膜新生血管和VEGF表達(dá)的抑制作用。 方法: 7日齡清潔級Wistar早產(chǎn)鼠仔80

6、只稱重隨機(jī)均分為兩組，實(shí)驗(yàn)組于出生后7d置于75+1％氧箱內(nèi)飼養(yǎng)5d后回到正?？諝怙曫B(yǎng)5d,對照組于常氧環(huán)境飼養(yǎng)。兩組分別從日齡12、14、16d開始予左眼玻璃體腔注射HIF-1α反義寡核苷酸。右眼作為自身對照。一部分實(shí)驗(yàn)組左眼注入生理鹽水.即得到五組標(biāo)本：分別為正常眼(A)，正常眼+反義HIF(A1)，ROP眼(B)，ROP+反義HIF(B1)，ROP眼+生理鹽水(B2)。實(shí)驗(yàn)組和對照組各取新生鼠15只，鼠齡分別為12、14、17d，

7、各5只(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)有一只左眼注射生理鹽水)，進(jìn)行視網(wǎng)膜鋪片。以觀察五種視網(wǎng)膜血管發(fā)育及增生情況，每組各取10只新生鼠，均于生后第17d頸椎脫臼處死。摘除眼球，組織切片HE染色計(jì)數(shù)五組標(biāo)本突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)，免疫組化法觀察五組標(biāo)本視網(wǎng)膜各層VEGF和HIF-1α蛋白水平的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組和對照組各取新生鼠15只，鼠齡分別為12、14、17d，各5只(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)有一只左眼注射生理鹽水)半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)觀

8、察5組不同時(shí)間點(diǎn)VEGF和HIF-1αmRNA的變化及其對應(yīng)關(guān)系。 結(jié)果: 視網(wǎng)膜鋪片顯示A組：12d見少量無灌注區(qū)，周邊血管結(jié)構(gòu)清晰，14d無灌注區(qū)消失，血管形態(tài)基本正常，17d血管形態(tài)全部正常。A1組：12，14，17d視網(wǎng)膜血管形態(tài)和A組基本相同。B組：12d視網(wǎng)膜血管收縮變窄甚至閉塞，視網(wǎng)膜中央部有大片無灌注區(qū)，14d新生血管開始形成，17d視網(wǎng)膜大血管明顯擴(kuò)張、迂曲，大量新生血管形成。B1組17d視網(wǎng)膜大血管形態(tài)與A組

9、同日齡相似，新生血管較B組明顯減少。B2組的鋪片結(jié)果和B組近似。組織切片HE染色計(jì)數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)A，A1，B，B1，B2組分別為2.75±0.7164，2.70±0.7327，32.80±0.7678，28.9±0.9119，32.75±0.7164。B，B2組無顯著差異，與A，A1組差異有顯著性，Bl組與B，B2組差異有顯著性。免疫組化結(jié)果A，Al組顯示VEGF在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中有少許表達(dá)。HIF-1α無表

10、達(dá)，兩組無明顯差異。B,B2組較A,A1組VEGF在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿和胞-核中表達(dá)明顯增加，HIF-1α在胞核中有表達(dá)，兩組無明顯差異。Bl組VEGF在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿和胞核中表達(dá)，HIF-1a在胞核中表達(dá)均較B,B2組明顯減少。RT-PCR結(jié)果顯示B組較A,A1組日齡12d VEGF表達(dá)下降，14，17d VEGF和HIF-1α表達(dá)均增高，差異有顯著性。B1組日齡17d VEGF和HIF-1α表達(dá)較B組明顯下降，A，A1組日齡