1、目的：涎腺腺樣囊性癌(SACC)，是一種常見的涎腺惡性腫瘤。其惡性程度高，侵襲性強，易復發(fā)、易早期轉移。且對放療、化療不敏感，手術治療難以根除。因此，尋求有效的輔助性治療手段非常必要。survivin是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成員，特異表達于人的胚胎組織以及多數(shù)人類腫瘤細胞。在成人，由于survivin主要特異地表達于腫瘤組織，使得反義survivin基因治療具有良好的靶向性、特異性及安全性。本實驗利用人涎腺腺樣囊性癌高

2、轉移細胞系Acc-M探討survivin反義寡核苷酸(ASODN)對survivin基因表達的影響，及其誘導腫瘤細胞凋亡的效果；同時建立Acc-M裸鼠移植瘤模型，探討survivin反義寡核苷酸對該腫瘤細胞形態(tài)結構、細胞凋亡以及腫瘤生長速度的影響，為人涎腺腺樣囊性癌的臨床基因治療提供實驗依據(jù)。 方法： 1.材料 (1)人涎腺腺樣囊性癌高轉移細胞系(Acc-M)。 (2)針對survivin基因的反義寡核苷

3、酸片段。 (3)15只SPF級雌性Balb/c裸小鼠，4-5周齡。 2.方法 (1)細胞培養(yǎng)：Acc-M細胞培養(yǎng)于RPMI1640含胎牛血清和雙抗的培養(yǎng)液中，5％CO2、37℃恒溫孵育。 (2)體外實驗：設計合成針對survivin基因的反義寡核苷酸片段。脂質體介導survivin反義寡核苷酸轉染Acc-M細胞，通過RT-PCR，Western-blot檢測survivin表達的改變，MTT測定細胞增殖抑

4、制，流式細胞術測定細胞凋亡率。 (3)動物實驗：建立裸鼠皮下移植模型，待腫瘤直徑達1.0cm，采用survivin反義寡核苷酸聯(lián)合脂質體作用于裸鼠移植瘤局部，并設正義管核苷酸(SODN)對照組和空白對照(NS)組，每4天瘤內注射一次，共治療13天，第14天麻醉后處死裸鼠，觀察移植瘤體積和瘤重的變化，流式細胞術測定細胞凋亡率，HE染色觀察移植瘤結構改變。 結果： 1.轉染ASODN組survivin表達下降，其中m

5、RNA表達下降達43.03％，顯著低于SODN組、脂質體組和空白對照組，蛋白表達下降36.03％，顯著低于SODN組、脂質體組和空白對照組。細胞凋亡率明顯提高，流式結果顯示ASODN組細胞凋亡率為25.9％。而SODN組為1.98％，脂質體組2.08％，空白對照組為1.93％。前者與后三組各組間均有顯著差異，而后三組之間無差別。MTT試驗顯示轉染ASODN組細胞增殖明顯受抑制，且與濃度有一定依賴性，ASODN組IR均增高，800nmol

6、/L和1000nmol/L組細胞抑制率分別達37.61％和46.42％，顯著高于其余各組。而SODN組、脂質體組與空白組間無明顯差異。 2.裸鼠移植瘤治療結束時，NS組、SODN組、ASODN組體積均數(shù)分別為(以cm3為單位)：3.09±0.06，2.92±0.13，1.309±0.27。ASODN組裸鼠腫瘤生長明顯受到抑制，抑制率為57.6％。NS組、SODN組、ASODN組腫瘤質量均數(shù)分別為(以g為單位)：4.97±0.54

7、，4.40±0.51，2.32±0.87，ASODN組抑瘤率為53.4％。肉眼觀察：腫瘤橢圓形，結節(jié)狀，有包膜，表面光滑，個別瘤體表面有破潰。剖面實性，灰白色，部分區(qū)域由黃白色豆渣樣物，似壞死組織。光鏡觀察：腫瘤片狀排列，細胞呈圓形或多邊形，胞漿紅染。胞核圓形，居中，核大而深染，核漿比例增大，異型性明顯，核分裂像易見。ASODN組中可見成片的凋亡細胞，細胞體積縮小，胞漿固縮，可見凋亡小體。SODN、NS組腫瘤細胞成片生長，偶見凋亡細胞。

8、流式細胞分析術檢測顯示ASODN組凋亡率達32.5％而SODN組、NS組凋亡率為6.22％和5.60％。 結論： 1.Survivin反義寡核苷酸能有效沉默涎腺腺樣囊性癌中survivin的表達。 2.細胞培養(yǎng)和裸鼠移植瘤實驗均證明Survivin反義寡核苷酸具有明顯促進SACC細胞凋凋亡，抑制其增殖的作用。 3.Survivin反義寡核苷酸聯(lián)合脂質體可作為SACC基因治療的新途徑，具有良好的臨床應用前景