1、中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所碩士學(xué)位論文靶向Survivin的抗腫瘤反義寡核苷酸先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的篩選姓名：王丹申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：王升啟20040601靶向Survivln的抗腫瘤反義寡核苷酸先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的篩選中文摘要中文摘要靶向sunrivin的抗腫瘤反義寡核苷酸先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的篩選SⅧ吖iv證是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因，被認(rèn)為是潛在的藥物作用靶標(biāo)。本研究旨在通過(guò)全長(zhǎng)基因?qū)ぐ屑夹g(shù)(FullIeng血ge

2、netargcting，F(xiàn)LGT)篩選靶向suⅣivin的抗腫瘤反義寡核苷酸并予以驗(yàn)證，同時(shí)為全長(zhǎng)基因?qū)ぐ屑夹g(shù)提供佐證。首先，克隆靶基因sun，ivm的全長(zhǎng)序列，體外轉(zhuǎn)錄出大量的靶mRNA；將人工合成的隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)與靶血斟A在進(jìn)行雜交，通過(guò)從雜交液中提取mRNA使與之有結(jié)合活性的反義寡核苷酸得到分離；將這些結(jié)合序列擴(kuò)增、克隆并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與mRNA序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)了15個(gè)反義結(jié)合位點(diǎn)；合成15個(gè)反義結(jié)合位點(diǎn)(A115)的寡核苷酸探針，制

3、備芯片；同位素標(biāo)記的靶mRNA與芯片雜交，15個(gè)位點(diǎn)中的12個(gè)有不同強(qiáng)度的雜交信號(hào)；進(jìn)一步用同位素標(biāo)記的靶mRNA與芯片雜交后RNaseH原位切割，觀察其切割活性，發(fā)現(xiàn)雜交信號(hào)較強(qiáng)的探針A3半數(shù)切割時(shí)間(Tl，2)也最長(zhǎng)，是酶切速度最慢的一個(gè)點(diǎn)。合成靶向上述15個(gè)位點(diǎn)的硫代反義寡核苷酸，處理肺癌細(xì)胞A549，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果表明，3個(gè)在芯片上沒(méi)有信號(hào)的反義寡核苷酸在細(xì)胞水平也沒(méi)有顯著的抑制效果，而其它12條反義寡核苷酸的

4、O8州給藥抑制率均達(dá)到70％以上。其中A3雖然與靶InRNA具有很強(qiáng)的結(jié)合活性，但是抑制率并不是很高，酶切速度慢可能是原因。結(jié)果表明，全長(zhǎng)基因?qū)ぐ屑夹g(shù)經(jīng)原位雜交校正后與細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)之間有良好的相關(guān)性。進(jìn)一步通過(guò)RTPCR和WjstemBlot分別驗(yàn)證反義寡核苷酸對(duì)靶基因“礬A和蛋白表達(dá)水平的影響。其中4條反義寡核苷酸可明顯抑制靶基因mRNA的表達(dá)，這4條中有2條可顯著抑制靶基因蛋白的表達(dá)。綜上，通過(guò)全長(zhǎng)基因?qū)ぐ锌梢暂^全較準(zhǔn)的找到靶r出mA