1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是嚴(yán)重危害人類健康的血管疾病，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，迄今為止提出了多種病源學(xué)說(shuō)，但具體原因尚未完全闡明。新近有研究結(jié)果顯示蛋氨酸(methionine)代謝中間產(chǎn)物S-腺苷同型半胱氨酸(S_adenosvlhomocvsteine，SAH)在As形成過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，而另一代謝中間產(chǎn)物同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)的升高可能只是一個(gè)伴隨現(xiàn)象。近年來(lái)，遺傳物質(zhì)DNA甲

2、基化這一基因組表遺傳修飾(epigenetic modi6cation)作為基因表達(dá)沉默的重要機(jī)制逐漸被人們認(rèn)識(shí)，基因組表遺傳修飾導(dǎo)致As相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄失調(diào)在As形成過(guò)程中扮演重要角色。研究發(fā)現(xiàn)As形成過(guò)程中基因DNA甲基化的一個(gè)顯著特點(diǎn)是整體基因組的低甲基化與部分特異基因啟動(dòng)子CpG島的高甲基化并存。蛋氨酸代謝產(chǎn)物SAH能反饋抑制甲基轉(zhuǎn)移酶(methVhransferase，MT)的活性，SAH是否通過(guò)影響DNA甲基化而導(dǎo)致基因表達(dá)改變

3、，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，進(jìn)而促進(jìn)As的發(fā)展值得深入探討。本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，考慮到SAH不能直接通過(guò)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)發(fā)揮作用，應(yīng)用SAHH抑制劑3-deazaadenosine(DZA)作為干預(yù)手段，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、增殖凋亡能力、氧化應(yīng)激及炎性分子表達(dá)等方面探討胞內(nèi)SAH升高對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷效應(yīng)，并進(jìn)一步從DNA甲基化這

4、一角度深入探討其作用機(jī)制，明確SAH在心血管疾病中的作用，為高蛋氨酸攝入引起血管損傷或心血管疾病機(jī)制提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為臨床營(yíng)養(yǎng)防治As提供新的途徑和理論依據(jù)。方法永生化的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科陳鵬教授惠贈(zèng)。HUVEC細(xì)胞經(jīng)50gmol/L、100gmol/L或200gmol/L的DZA處理24、48、72h，對(duì)

5、照組用等體積的滅菌雙蒸水代替DZA。利用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，電子顯微鏡觀察細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)變化，反相高效液相色譜法(reversed phase high-performanceliquid chromatography，RP-HPLC)測(cè)定胞內(nèi)SAH濃度，熒光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA)測(cè)定Hcy的濃度，細(xì)胞計(jì)數(shù)法、MTT及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力

6、，脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶缺口術(shù)端標(biāo)記法(TdT mediated dUTP nick ending labelling，TUNEL)法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，羥胺法測(cè)定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性，酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein，MCP-1

7、)的表達(dá)，蛋白印跡法(westernblot)檢測(cè)雌激素受體-α(estrogen receptor-alpha，ER-α)蛋白的表達(dá)，熒光定量RT-PCR法檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1(DNAmethyltransferase-1，DNMTl)、ER-α、MCP-1、EC-SOD mRNA的表達(dá)，胞嘧啶延伸法檢測(cè)整體基因組DNA甲基化，甲基化特異PCR(methylation special PCR，MSP)法檢測(cè)ER-α、MCP-1、胞

8、外超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase，ec—sod)基因啟動(dòng)子甲基化。采用SPSS10.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用WORD Excel軟件繪圖。 1.HUVEC細(xì)胞經(jīng)DZA處理后細(xì)胞密度明顯減少，排列稀疏，細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的收縮，形態(tài)顯得瘦小而不規(guī)則，兩極出現(xiàn)多個(gè)細(xì)長(zhǎng)的突起，核周出現(xiàn)大量脂滴聚集，核固縮，染色質(zhì)邊聚且腫脹，線粒體變形，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核膜皺褶，核變性。

9、 2.對(duì)照組胞內(nèi)SAH的濃度為1.32±0.35 nmol/mg protein，隨著DZA作用濃度的增加，胞內(nèi)SAH的濃度逐漸升高(P

10、C細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為24.1﹪～69.6﹪，增殖抑制率為10.8﹪～77.6﹪，主要使細(xì)胞生長(zhǎng)受阻于G<,1>/G<,0>期(由正常對(duì)照的53.46±12.35﹪上升至58.21±13.24﹪～86.20±13.57﹪)，而S期細(xì)胞數(shù)減少(由正常對(duì)照的35.19±8.96﹪下降至33.18±8.55﹪～8.10±2.46﹪)。 4.對(duì)照組HUVEC細(xì)胞的凋亡率為O.55±0.15﹪，經(jīng)DZA處理后，其凋亡率增加到2.53±0.5

11、6﹪～19.98±3.46﹪，提示DZA能促進(jìn)HUVEC細(xì)胞凋亡(P

12、Tl mRNA表達(dá)和整體基因組甲基化的水平較高，經(jīng)不同濃度的DZA處理后，DNMTl mRNA表達(dá)和整體基因組的甲基化水平降低(P<0.05)。 7.對(duì)照組HUVEC細(xì)胞ER-α、MCP-1、ec-sod基因啟動(dòng)子處于甲基化狀態(tài)，經(jīng)三種不同濃度的DZA處理72h后，其甲基化狀態(tài)不發(fā)生改變。 本研究結(jié)果綜合顯示，DZA能升高HUVEC細(xì)胞內(nèi)SAH含量，降低Hcy的含量。胞內(nèi)SAH含量升高后，細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力降低，生長(zhǎng)受阻于