1、研究背景:
　　在人體內(nèi)骨的內(nèi)穩(wěn)態(tài)是由骨重建維持的，骨重建包括陳舊的或者受損的骨由破骨細胞清除和成骨細胞生成新骨代替兩部分。當骨重建失去平衡時會導致骨量減少，如骨質(zhì)疏松，風濕性關(guān)節(jié)炎，Paget病等;或者骨量紊亂增加，形成骨硬化癥等。破骨細胞和成骨細胞活性的調(diào)節(jié)是由全身激素，在骨顯微環(huán)境中相鄰細胞分泌的細胞因子和生長因子等共同完成的。
　　Notch信號通路廣泛表達于胚胎和成熟個體組織，是高度保守的信號通路，對于調(diào)控胚胎發(fā)育

2、、成熟組織器官穩(wěn)態(tài)及免疫細胞發(fā)揮功能等方面具有重要作用。Notch信號通路包括Notch配體、受體以及下游信號傳導分子及調(diào)節(jié)分子。Notch受體蛋白經(jīng)過furin-like蛋白酶，整合素金屬蛋白酶(ADAM)和γ-分泌酶多蛋白復合體介導的三次酶切，釋放了具有活性的細胞內(nèi)區(qū)(NICD)。NICD隨后進入細胞核，激活CSL介導的Notch信號通路及下游的HES基因。
　　在人類和小鼠的基因方面的研究表明，Notch信號通路在骨的生長發(fā)

3、育及代謝中扮演著重要的角色。Notch信號通路在誘導分化的早期可以刺激間充質(zhì)細胞向軟骨分化，但是在分化的后期Notch信號通路卻抑制了進一步的分化，在骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化早期，Notch信號可以維持干細胞處于未分化狀態(tài)。Notch信號通路也可以通過多種方式調(diào)節(jié)破骨細胞的分化。Notch信號通路既可以直接抑制破骨細胞生成，也可以通過降低成骨細胞分泌M-CSF和RANKL等抑制破骨細胞生成。Notch信號通路對于骨重建的調(diào)節(jié)作用復

4、雜，具有時效性。
　　Numb是膜相關(guān)受體蛋白，是一種細胞命運決定因子，Numb可以招募E3泛素連接酶，介導NICD內(nèi)吞至溶酶體降解，拮抗Notch信號通路影響不同細胞的發(fā)育命運。
　　LNX蛋白（Ligand of Numb-proteinX）是第一種被描述的含有PDZ結(jié)構(gòu)的環(huán)指-E3泛素連接酶家族成員。LNX作為含有PDZ結(jié)構(gòu)的泛素連接酶，在泛素連接酶和協(xié)調(diào)信號通路等方面都發(fā)揮重要。LNX蛋白可以連接泛素和Numb，使其

5、發(fā)生蛋白酶依賴性的降解。
　　LNX和Numb在破骨細胞中的表達水平，以及他們是否調(diào)節(jié)Notch信號通路在破骨細胞中尚未有研究和報道，有待進一步的研究。
　　實驗共分三大部分:
　　第一部分
　　目的:確定LNX在破骨細胞誘導分化過程中的表達水平的變化。
　　方法:采用Rankl體外誘導骨髓單核-巨噬細胞分化的方法生成破骨細胞，并檢測破骨細胞活性，用RT-PCR檢測LNX基因在誘導形成破骨細胞過程中表達水平

6、。
　　結(jié)果:用Rankl體外誘導骨髓單核-巨噬細胞分化的方法可以生成具有骨吸收能力的破骨細胞，隨著破骨細胞的分化，LNX1和LNX2基因水平均有上升，而LNX2表達水平明顯高于LNX1，有顯著性差異。
　　結(jié)論:LNX2可能對于破骨細胞分化有重要調(diào)節(jié)作用。
　　第二部分
　　目的:觀察沉默LNX2對于破骨細胞分化和功能的影響;了解LNX2調(diào)控破骨細胞分化和功能的可能機制。
　　方法:構(gòu)建含LNX2 shR

7、NA的慢病毒，轉(zhuǎn)染骨髓單核-巨噬細胞并誘導向破骨細胞分化，觀察沉默LNX2基因后對于破骨細胞分化和功能的影響。用WesternBlot，RT-PCR，免疫熒光等研究LNX2相關(guān)的Numb蛋白和Notch信號通路的改變。
　　結(jié)果:沉默LNX2后，破骨細胞的分化及功能被有效抑制，破骨細胞標記物基因和蛋白水平降低;沉默LNX2會使得Numb蛋白水平上升，免疫熒光顯示Numb熒光表達量明顯升高，在細胞膜及細胞核周圍均有大量分布;降低了L

8、NX2的表達水平同時會降低了NICD1和NICD2的表達水平。免疫熒光顯示Notch2熒光表達量明顯降低，在細胞核周圍只有少量分布且Notch信號通路下游的Hes1基因表達水平有較大水平的降低。
　　結(jié)論:LNX2是破骨細胞分化所必需的關(guān)鍵性蛋白;LNX2可能通過Numb和Notch信號通路影響了破骨細胞的分化。
　　第三部分
　　目的:觀察過表達LNX2對于破骨細胞分化和功能的影響;了解LNX2調(diào)控破骨細胞分化和功能

9、的可能機制。
　　方法:構(gòu)建含人全長LNX2 DNA的逆病毒，轉(zhuǎn)染骨髓單核-巨噬細胞并誘導向破骨細胞分化，觀察過表達LNX2基因后對于破骨細胞分化和功能的影響;用Western Blot，RT-PCR等研究Numb蛋白水平的改變。
　　結(jié)果:過表達人全長LNX2后，破骨細胞的分化受到部分抑制，但是受抑制程度遠低于沉默LNX2時受抑制程度，破骨細胞標記物和蛋白水平部分降低，Numb蛋白表達水平部分上升。
　　結(jié)論:過表達