1、機(jī)體維持骨組織不斷更新，保持生命活力是依靠骨代謝完成的。骨代謝平衡一旦被打破，機(jī)體便會(huì)出現(xiàn)各類代謝性骨病，其中骨營(yíng)養(yǎng)不良性疾病如骨質(zhì)疏松主要是由破骨細(xì)胞(osteoclasts，OC)產(chǎn)生的骨吸收大于成骨細(xì)胞(osteoblasts，OB)產(chǎn)生的骨再建所引起的。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體受到骨吸收刺激時(shí)，成骨細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞膜上表達(dá)的細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配基(receptoractivatorofnuclearfactor-κBligand

2、，RANKL)，通過(guò)與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞膜上細(xì)胞核因子-κB受體活化因子(receptoractivatorofnuclearfactor-κB，RANK)結(jié)合，促進(jìn)OC的分化和成熟。核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路是參與調(diào)控OPG抑制OC分化成熟的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)作為NF-κB特異性抑制劑被廣泛應(yīng)用。本研究采用OPG/RANK/RANKL調(diào)控途徑在體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株生成OC，

3、在此基礎(chǔ)上研究OPG抑制動(dòng)物OC分化成熟的NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為從分子水平揭示動(dòng)物骨營(yíng)養(yǎng)不良性疾病的發(fā)生及防治提供理論依據(jù)。
　　 1.RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)及RANKL、OPG、PDTC對(duì)細(xì)胞增殖的影響
　　 RAW264.7細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中，于5％CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。MTT法檢測(cè)其生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的增加，細(xì)胞增殖速度逐漸增加，第3d進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，第5d進(jìn)入穩(wěn)定期。通過(guò)MTT法，檢測(cè)不同濃度R

4、ANKL(0、10、30、50、70ng/mL)、OPG(0、10、20、40、50ng/mL)和PDTC(0、10、50、100、150μM)對(duì)該細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明:不同濃度RANKL均抑制細(xì)胞的增殖，隨濃度增加抑制作用增強(qiáng)，選取30ng/mL為實(shí)驗(yàn)濃度;OPG在0～50ng/mL濃度范圍內(nèi)，對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯作用，選取0、20、50ng/mL為實(shí)驗(yàn)濃度;不同濃度的PDTC均抑制細(xì)胞的增殖，隨濃度增加抑制作用增強(qiáng)，選取100μM為

5、作用濃度。
　　 2.RANKL體外誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞株分化為OC及OPG的影響
　　 RAW264.7細(xì)胞以5×103cells/mL密度接種于96孔板，加入α-MEM培養(yǎng)基，于5％CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換液，至第6d。5％多聚甲醛固定，以抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）試劑盒染色，其中含有三個(gè)或三個(gè)以上細(xì)胞核的TRAP陽(yáng)性多核細(xì)胞即為OC。在此基礎(chǔ)上，分組:A組為空白組，B組添加20ng/mLOPG，C組

6、添加30ng/mLRANKL，D組添加30ng/mLRANKL+20ng/mLOPG，E組添加30ng/mLRANKL+50ng/mLOPG。誘導(dǎo)至第6d，5％多聚甲醛固定，TRAP試劑盒染色，生成的OC計(jì)數(shù)，結(jié)果表明:A、B組只有極少量的OC生成;C組生成TRAP陽(yáng)性多核細(xì)胞數(shù)量極顯著高于其他組(P＜0.01);D組生成TRAP陽(yáng)性多核細(xì)胞數(shù)量極顯著低于C組(P＜0.01)，極顯著高于A、B、E組(P＜0.01);E組生成TRAP陽(yáng)性

7、多核細(xì)胞數(shù)量極顯著低于C、D組(P＜0.01)。由此可見(jiàn)，C、D、E組在添加相同RANKL的基礎(chǔ)上，隨著添加OPG濃度的增加，OC數(shù)量逐漸減少，至50ng/mLOPG時(shí)，只有極少量的OC生成。
　　 3.OPG對(duì)OC形成過(guò)程中NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵信號(hào)分子表達(dá)的影響
　　 在誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化生成OC的過(guò)程中進(jìn)行如下處理，A組為對(duì)照組，B組添加20ng/mLOPG，C組添加30ng/mLRANKL，D組添加

8、30ng/mLRANKL+20ng/mLOPG，E組添加30ng/mLRANKL+50ng/mLOPG。提取細(xì)胞核蛋白、漿蛋白和細(xì)胞全蛋白，通過(guò)蛋白印跡(WesternBolt)技術(shù)檢測(cè)NF-κBp65及IκB的表達(dá)。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組NF-κBp65表達(dá)量隨添加OPG濃度的增加而降低，細(xì)胞IκBα、IκBβ表達(dá)量逐漸增加。
　　 添加100μMPDTC阻斷NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后，檢測(cè)上述關(guān)鍵信號(hào)分子的表達(dá)。在誘導(dǎo)RAW264.

9、7細(xì)胞分化生成OC的過(guò)程中進(jìn)行如下處理，A組添加100μMPDTC，B組添加20ng/mLOPG+100μMPDTC，C組添加30ng/mLRANKL+100μMPDTC，D組添加30ng/mLRANKL+20ng/mLOPG+100μMPDTC，E組添加30ng/mLRANKL+50ng/mLOPG+100μMPDTC。處理結(jié)束后提取細(xì)胞核蛋白、漿蛋白以及細(xì)胞全蛋白，通過(guò)蛋白印跡(WesternBolt)技術(shù)檢測(cè)NF-κBp65及Iκ