1、迄今為止，適應(yīng)性免疫的起源一直是免疫學(xué)研究的關(guān)鍵問(wèn)題。文昌魚(yú)被認(rèn)為是最接近于脊椎動(dòng)物的祖先，自從他們被發(fā)現(xiàn)，一直是研究脊椎動(dòng)物的起源與進(jìn)化機(jī)制的經(jīng)典動(dòng)物。 為了在頭索文昌魚(yú)中尋找適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的分子證據(jù)，本研究用副溶血弧菌及金黃色葡萄球菌長(zhǎng)期感染文昌魚(yú)來(lái)調(diào)查免疫起源。在差減文庫(kù)中，許多急性期反應(yīng)蛋白像補(bǔ)體因子3，鼠李糖結(jié)合因子，肽聚糖結(jié)合蛋白SC2等也出現(xiàn)在文庫(kù)中，同時(shí)，新的免疫基因象高密度脂蛋白，卵黃蛋白原等大量上調(diào)，暗示了與

2、急性期不同的免疫策略。而且，本文還論證了卷入脊椎動(dòng)物負(fù)調(diào)控路徑的分子證據(jù)。為進(jìn)一步調(diào)查這一過(guò)程的分子事件提供了重要線(xiàn)索，進(jìn)一步功能研究這些新發(fā)現(xiàn)的基因?qū)⒂兄谏钊胙芯棵庖呦到y(tǒng)的起源和進(jìn)化。 通過(guò)表達(dá)序列標(biāo)簽策略分析不同的克隆，本研究發(fā)現(xiàn)匹配抑制NF-κB活性的A20結(jié)合蛋白的一個(gè)EST XP 692717在差減文庫(kù)中高度富集，通過(guò)RACE克隆了這個(gè)新基因，并命名為amphiABIN。序列分析表明amphiABIN與脊椎動(dòng)物的AB

3、IN-2有最高的同源性。與人和小鼠的ABIN序列比對(duì)表明，該基因蛋白含有一個(gè)顯著的大約70個(gè)氨基酸的ABIN同源框。Northern雜交證明該基因在感染后顯著上調(diào)，尤其是第4周和第5周，這暗示了該基因在文昌魚(yú)的抗感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。原位雜交表明該基因主要在肝盲囊和性腺這兩個(gè)文昌魚(yú)的主要免疫器官表達(dá)，同時(shí)在胚胎發(fā)育的8小時(shí)到成魚(yú)階段也表達(dá)上調(diào)，表明該蛋白在免疫調(diào)節(jié)和胚胎發(fā)育中有重要作用。這些表達(dá)模式反應(yīng)了ABIN家族在進(jìn)化過(guò)程中的原始

4、功能或者說(shuō)亞功能形式。 為探究amphiABIN基因在文昌魚(yú)基因組中的存在方式，對(duì)其進(jìn)行了Southern blot分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明amphiABIN在文昌魚(yú)基因組中以單拷貝的形式存在。通過(guò)NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)amphiABIN在進(jìn)化上與脊椎動(dòng)物ABIN-2更為接近。這也暗示ABIN-1和ABIN-3可能是通過(guò)amplliABIN的復(fù)制所形成的，ABIN-1和ABIN-3在進(jìn)化中可能獲得了新的功能，而amphiABIN則保

5、留原始的功能狀態(tài)。轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B在先天免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用，NF-κ B的失控會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的炎癥因子，并與慢性炎癥疾病及癌癥相關(guān)，所以必須嚴(yán)格控制。但是關(guān)于NF-κ B的調(diào)控機(jī)制并不是很清楚，尤其是在無(wú)脊椎到脊椎動(dòng)物的轉(zhuǎn)變過(guò)程中。研究結(jié)果顯示與脊椎動(dòng)物該成員類(lèi)似，amptliABIN的過(guò)表達(dá)顯著地抑制腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素1引起的NF-κ B活性減少，表明ABIN成員在進(jìn)化過(guò)程中對(duì)NF-κ B調(diào)控的保守性。突變分析表明，

6、像其他的脊椎動(dòng)物成員一樣，AHD2結(jié)構(gòu)對(duì)這種抑制作用最為明顯。 通過(guò)免疫共沉淀和pull-down實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)amphiABIN能特定的與文昌魚(yú)腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白TRAF2，TRAF4和TRAF6相互作用。與TRAF成員單獨(dú)表達(dá)增加NF-κ B活性比較，amplliABIN與TRAF成員共轉(zhuǎn)染顯著抑制NF-κ B的活性，進(jìn)一步暗示了它們之間的相互作用。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)amphiABIN干擾NF-κ B的活性發(fā)生在TRAF2和TRA

7、F4下游，但對(duì)于TRAF6并沒(méi)有影響，可能是因?yàn)門(mén)RAF6只受白介1或者Toll受體的誘導(dǎo)。本文推測(cè)這種作用的形成可能是由于一旦amphiABIN與文昌魚(yú)TRAF結(jié)合，從而競(jìng)爭(zhēng)TRAF與下游信號(hào)分子IKK γ的結(jié)合，導(dǎo)致NF-κ B激活的失敗。除了抑制NF-κ B，amphiABIN在細(xì)胞中還呈現(xiàn)抗凋亡的活性，這也為該基因在細(xì)菌感染后的所發(fā)生的保護(hù)效應(yīng)提供了合理解釋。 總之，本文第一次報(bào)道了文昌魚(yú)長(zhǎng)期感染的分子表達(dá)譜，論證了am