1、背景和目的：胃癌世界發(fā)病率在腫瘤中占第四,腫瘤相關(guān)死亡率高居第二。有研究報道早期胃癌患者的5年生存率達到95％,晚期胃癌的生存率只有10%～20%,嚴重危害著人類的健康。目前國際公認的晚期胃癌的治療原則仍然是以化療為主的綜合治療。雖然隨著5-氟尿嘧啶類藥物的廣泛應用以及紫杉類、伊立替康和靶向藥物等新藥的應用,胃癌化療療效較前有所改善,但仍有相當比例的胃癌患者因為對常規(guī)化療藥物不敏感導致該部分胃癌患者臨床治療效果差,因此開辟胃癌新的臨床治

2、療途徑尤為重要。目前已知抑癌基因的異常甲基化不僅參與胃癌的發(fā)生發(fā)展,與胃癌細胞對化療藥物的敏感性也密切相關(guān)。本研究通過探討5-氮雜2-脫氧胞苷(5-Aza-dC)、曲古抑菌素A(TSA)、紫杉醇聯(lián)合5-氟尿嘧啶三者單獨或聯(lián)合對于不同分化程度的人胃腺癌細胞株MGC-803(高分化)、SGC-7901(中分化)、MKN-45(低分化)中reprimo基因甲基化和mRNA表達水平的影響,初步探討5-Aza-dC、TSA、紫杉醇及5-氟尿嘧啶單

3、獨或聯(lián)合使用對胃癌細胞生長及甲基化狀態(tài)的影響。本研究在體外細胞實驗的基礎上,運用兩種方法建立了胃癌裸鼠模型,比較兩種建模方法,為進一步評價上述藥物的體內(nèi)作用及其機制等提供有力的實驗工具。
　　材料與方法：①采取5-Aza-dC、TSA、紫杉醇+5-氟尿嘧啶三組藥物單獨或聯(lián)合藥的方式,對不同分化程度的胃腺癌細胞株MGC-803、SGC-7901及MKN-45細胞株進行處理,其中5-Aza-dC組:在細胞接種24小時后,用10μM的5

4、-Aza-dC處理細胞72小時;TSA組:在細胞接種48小時后,用1μM的TSA的處理細胞48小時;紫杉醇+5-氟尿嘧啶組:加入0.3μM的紫杉醇和75mg的5-氟尿嘧啶處理細胞24小時;5-Aza-dC+TSA:細胞接種24小時后,用10μM的5-Aza-dC處理細胞24小時,然后加入1μMTSA同時處理48小時;紫杉醇+5-氟尿嘧啶+TSA組:向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入含1μM的TSA處理細胞48小時后加入0.3μM的紫杉醇和75mg/L的5-

5、氟尿嘧啶,繼續(xù)培養(yǎng)24小時;5-Aza-dC組+TSA組+紫杉醇聯(lián)合5-氟尿嘧啶組:向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入10μM的5-Aza-dC,24h后加入1μM的TSA,48小時后加入0.3μM的紫杉醇和75mg/L的5-氟尿嘧啶,繼續(xù)培養(yǎng)24小時;同時設立空白對照組(僅加入培養(yǎng)基培養(yǎng)),利用光學顯微鏡觀察各種藥物單獨或聯(lián)合處理前后胃癌細胞形態(tài)的變化,并利用臺盼藍染色方法測定各組細胞的活率。
　　②采取5-Aza-dC、TSA、紫杉醇+5-氟尿嘧

6、啶三組藥物單獨或聯(lián)合用藥的方式,對不同分化程度的胃腺癌細胞株MGC-803、SGC-7901及MKN-45細胞進行處理,同時設立空白對照組,利用光學顯微鏡觀察各種藥物單獨或聯(lián)合處理前后胃癌細胞形態(tài)的變化,并利用臺盼藍染色方法測定各組細胞的活率;
　?、奂谆禺愋訮CR法(MSP):采用MSP檢測各組藥物干預72小時后人胃腺癌MGC-803、SGC-7901、MKN-45細胞株中reprimo基因啟動子區(qū)甲基化的狀態(tài)。
　　

7、④逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR):采用RT-PCR檢測各組藥物干預72小時后人胃腺癌MGC-803、SGC-7901、MKN-45細胞株reprimo基因mRNA表達水平。
　　⑤觀察并比較人胃癌細胞懸液直接注射法和瘤轉(zhuǎn)瘤法兩種方法所建立的模型腫瘤移植成功率及瘤體生長速度,用甲基化特異性PCR法檢測移植瘤組織中reprimo基因的甲基化水平并采用免疫組化法檢測移植瘤的Ki-67和CD31分子表達。
　　結(jié)果：①光學顯微鏡下觀察

8、發(fā)現(xiàn)三種不同分化的人胃腺癌細胞株MGC-803、SGC-7901、MKN-45形態(tài)均為上皮樣,呈梭形,有些可見偽足,5-AzadC、TSA、紫杉醇+5-氟尿嘧啶單藥組;5-Aza-dC+TSA、5-Aza-dC+紫杉醇+5-氟尿嘧啶、TSA﹢紫杉醇加5-氟尿嘧啶兩藥聯(lián)合組;5-Aza-dC+TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶三藥聯(lián)合組分別處理培養(yǎng)三組細胞株72小時后細胞體積增大,核縮小,核漿比減小,培養(yǎng)24小時即出現(xiàn)部分細胞呈多邊形,72小時

9、出現(xiàn)大量貼壁細胞懸浮,大部分細胞形態(tài)改變明顯;單藥處理組TSA比5-Aza-dC作用明顯,紫杉醇+5-氟尿嘧啶最用最強;兩藥聯(lián)合后作用比單藥明顯,TSA聯(lián)合紫杉醇+5-氟尿嘧啶;三組藥物聯(lián)合處理作用更強;臺盼藍染色后以對照組細胞數(shù)為100%對藥物處理組進行比較,單藥組紫杉醇+5-氟尿嘧啶處理培養(yǎng)后細胞存活數(shù)相比5-Aza-dC、TSA少;兩藥聯(lián)合組TSA聯(lián)合紫杉醇+5-氟尿嘧啶細胞處理培養(yǎng)后存活數(shù)較其他兩組少;發(fā)現(xiàn)三藥聯(lián)合處理培養(yǎng)后腫瘤

10、細胞存活數(shù)最少。
　?、贛SP檢測顯示三種不同分化的人胃腺癌細胞株MGC-803、SGC-7901、MKN-45在對照組中reprimo基因啟動子區(qū)CpG島均表現(xiàn)為高甲基化,非甲基化呈微弱水平;給予5-Aza-dC組、TSA組、紫杉醇+5-氟尿嘧啶組、5-Aza-dC+TSA組、5-Aza-dC+紫杉醇+5-氟尿嘧啶組、TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶組、5-Aza-dC+TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶組藥物分別處理72小時后,單藥組較

11、對照組reprimo基因啟動子區(qū)CpG島發(fā)生DNA甲基化水平減低,非甲基化水平升高;兩藥聯(lián)合組較單藥組reprimo基因啟動子區(qū)CpG島發(fā)生DNA甲基化水平減低,非甲基化水平升高;三藥聯(lián)合組較兩藥聯(lián)合組reprimo基因啟動子區(qū)CpG島發(fā)生DNA甲基化水平減低,非甲基化水平升高。
　?、跼T-PCR檢測發(fā)現(xiàn)三種不同分化的人胃腺癌細胞株MGC-803、SGC-7901、MKN-45在對照組中mRNA表達水平低,5-AzadC、TSA

12、、紫杉醇+5-氟尿嘧啶、5-Aza-dC+TSA、5-Aza-dC+紫杉醇加5-氟尿嘧啶、TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶、5-Aza-dC+TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶8組藥物分別處理72小時后,MGC-803細胞株reprimo基因八組灰度比值分別為:對照組(0.1364±0.0279)、5-Aza-dC(0.3722±0.0259)、TSA(0.3368±0.0225)、紫杉醇+5-氟尿嘧啶(0.2059±0.0266)、5-Aza-

13、dC+TSA(0.4370±0.0253)、5-Aza-dC+紫杉醇+5-氟尿嘧啶(0.4205±0.0424)、TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶組(0.3492±0.0152)、5-Aza-dC+TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶(0.5569±0.0154);SGC-7901細胞株reprimo基因八組灰度比值分別為:對照組(0.1713±0.0296)、5-Aza-dC(0.4285±0.0165)、TSA(0.3850±0.0103)、紫

14、杉醇+5-氟尿嘧啶(0.2240±0.0355)、5-Aza-dC+TSA(0.4728±0.0222)、5-AzadC+紫杉醇+5-氟尿嘧啶(0.4270±0.0028)、TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶組(0.3956±0.0186)、5-Aza-dC+TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶(0.5737±0.0157);MKN-45細胞株reprimo基因八組灰度比值分別為:對照組(0.2096±0.0339)、5-Aza-dC(0.4564±

15、0.0074)、TSA(0.4253±0.0091)、紫杉醇+5-氟尿嘧啶(0.2325±0.0156)、5-Aza-dC+TSA(0.4975±0.0136)、5-Aza-dC+紫杉醇+5-氟尿嘧啶(0.4718±0.0151)、TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶組(0.4353±0.0111)、5-Aza-dCTSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶(0.6097±0.0153);三組細胞單藥組較對照組reprimo基因mRNA表達水平升高(P<0.

16、05);兩藥聯(lián)合組較單藥組reprimo基因mRNA表達水平升高(P<0.05);三藥聯(lián)合組5-Aza-dC+TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶較兩藥聯(lián)合組reprimo基因mRNA表達水平升高(P<0.05)。④細胞懸液直接注射組的瘤體成瘤速度較瘤轉(zhuǎn)瘤組慢(P<0.05);瘤轉(zhuǎn)瘤組的瘤轉(zhuǎn)瘤組的reprimo基因甲基化水平及Ki-67和CD31的表達均高于細胞懸液直接注射組(P<0.05)。
　　結(jié)論：無藥物處理的情況下,人胃腺癌細胞株

17、MGC-803、SGC-7901、MKN-45形態(tài)均為上皮樣,呈梭形,有些可見偽足,reprimo基因甲基化程度較高,mRNA表達水平較低,在給予5-Aza-dC、TSA、紫杉醇+5-氟尿嘧啶單獨或聯(lián)合處理后,上述細胞均出現(xiàn)不同程度的形態(tài)改變、reprimo基因甲基化程度降低、mRNA表達水平明顯升高,其中以5-Aza-dC+TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶聯(lián)合組效果最為明顯,上述結(jié)果為胃癌臨床治療及采用新的聯(lián)合用藥方案提供了重要的實驗依據(jù)