1、背景:
　　肝癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤,中國(guó)是該腫瘤的高發(fā)區(qū),每年約有11萬(wàn)人死于肝癌,死亡數(shù)占全球肝癌總病例數(shù)的45％,居第一,是嚴(yán)重危害我國(guó)人民生命健康的嚴(yán)重疾病之一。早期肝癌的目前仍首選外科手術(shù),但由于各種原因,當(dāng)前總體肝癌的切除率仍較低且復(fù)發(fā)率相當(dāng)高。臨床需包括藥物化療等其他治療手段配合提高其治愈率和生存率。然而,目前證實(shí)的僅有少數(shù)幾個(gè)藥物(如順鉑、阿霉素等)對(duì)肝癌較為有效,但普遍存在著有效率偏低而伴有不同程度的胃腸道反

2、應(yīng)及骨髓抑制等毒、副作用,臨床運(yùn)用有限。
　　上世紀(jì)中后期,我國(guó)學(xué)者首先試用中藥砒霜的主要成分三氧化二砷治療急性早幼粒細(xì)胞性白血病(APL),近年的臨床研究發(fā)現(xiàn)其有高效、高緩解率、毒副作用少且與其它化療藥物無(wú)交叉耐藥性等優(yōu)點(diǎn),并受到國(guó)內(nèi)外腫瘤研究界的高度關(guān)注。
　　作為國(guó)產(chǎn)三氧化二砷的水溶制劑---亞砷酸注射液,目前已在我國(guó)開(kāi)始批準(zhǔn)生產(chǎn),但臨床適應(yīng)癥僅限于APL的治療。鑒于有報(bào)道三氧化二砷有抗肝癌作用,對(duì)于其衍生物——亞砷酸

3、注射液能否有效用于肝細(xì)胞癌的治療及其作用機(jī)制如何,目前仍需做進(jìn)一步了解。
　　目的:
　　觀(guān)察亞砷酸注射液對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響,并進(jìn)一步研究亞砷酸對(duì)肝癌細(xì)胞內(nèi)活性氧、線(xiàn)粒體跨膜電位等凋亡相關(guān)因素的影響,探討亞砷酸注射液抗肝癌的效果及作用機(jī)制。為臨床應(yīng)用亞砷酸注射液治療肝癌做初步探索。
　　方法:
　　1)肝細(xì)胞癌Mahlavu株的培養(yǎng)細(xì)胞為肝癌模型。在37℃、5%CO2和95%空氣環(huán)境細(xì)胞6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)至

4、達(dá)每孔約2×104個(gè)細(xì)胞時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分亞砷酸作用組(下稱(chēng)實(shí)驗(yàn)組,有0.3、1.0、1.5和3.0μg/ ml4個(gè)亞砷酸濃度);加生理鹽水對(duì)照的作用組(下稱(chēng)對(duì)照組);細(xì)胞預(yù)先用200U/ ml過(guò)氧化氫酶(CAT)處理過(guò)的亞砷酸作用組(下稱(chēng)預(yù)處理組)。倒置顯微鏡下觀(guān)察實(shí)驗(yàn)過(guò)程中細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。
　　2)MTT(噻唑藍(lán))比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化:對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和預(yù)處理組各自加入對(duì)照及各實(shí)驗(yàn)濃度的亞砷酸后,再培養(yǎng)12、24和48h,加

5、入MTT溶液,酶標(biāo)儀測(cè)定其OD值。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)管OD值/對(duì)照管OD值)×100%。
　　3)細(xì)胞凋亡檢測(cè):實(shí)驗(yàn)組、預(yù)處理組、對(duì)照組分別作用24 h和48 h處理后,PI(碘化吡啶)染色后,流式細(xì)胞儀測(cè)定DNA凋亡峰和凋亡率。
　　4)胞內(nèi)活性氧(ROS)的檢測(cè):實(shí)驗(yàn)組、預(yù)處理組、對(duì)照組分別作用1 h、2 h處理后,ROS標(biāo)記專(zhuān)用熒光染料DCFH-DA染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS水平。
　　5)細(xì)胞線(xiàn)粒體跨膜電位(△

6、ψm)的檢測(cè):實(shí)驗(yàn)組、預(yù)處理組、對(duì)照組分別作用3、6、12 h處理后,△ψm標(biāo)記專(zhuān)用熒光染料DIOC6染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)△ψm水平。
　　結(jié)果:
　　1)亞砷酸對(duì)人肝癌 Mahlavu細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響:倒置顯微鏡下觀(guān)察實(shí)驗(yàn)開(kāi)始所有細(xì)胞均呈成群、多角形、貼壁正常生長(zhǎng),細(xì)胞間連接緊密。24 h后,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度變緩慢,部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞外形變腫大或不規(guī)則形態(tài),漂浮死細(xì)胞增多。作用48 h后實(shí)驗(yàn)組呈現(xiàn)分裂的細(xì)胞更少,細(xì)胞間

7、連接疏松,甚至細(xì)胞成片脫落,細(xì)胞體積較大,外形不規(guī)則,大量細(xì)胞漂浮死亡。對(duì)照組作用時(shí)間內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖良好,細(xì)胞形態(tài)也無(wú)明顯改變。預(yù)處理組細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)組形態(tài)改變相似。
　　2)亞砷酸對(duì)人肝癌Mahlavu細(xì)胞增殖的影響:MTT法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)亞砷酸作用12、24、48 h后的人肝癌Mahlavu細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)。增殖率變化曲線(xiàn)呈增殖率隨亞砷酸濃度、作用時(shí)間的增加而下降趨勢(shì)。不同作用濃度、作用時(shí)間的亞砷酸作用后細(xì)胞增殖率的差異

8、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。等時(shí)間點(diǎn)等亞砷酸濃度的細(xì)胞增殖率實(shí)驗(yàn)組較預(yù)處理組低(P<0.05)。
　　3)亞砷酸對(duì)人肝癌Mahlavu細(xì)胞凋亡的影響:對(duì)照組未檢測(cè)到明顯的細(xì)胞凋亡峰。實(shí)驗(yàn)組經(jīng)24、48h作用后可出現(xiàn)凋亡細(xì)胞特征的凋亡峰,其中1.5μg/ml實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞24、48 h凋亡率分別為28.57%±6.57%和49.14%±6.54%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。1.5μg/ml作用濃度等時(shí)間點(diǎn)凋亡率實(shí)驗(yàn)組高于與預(yù)處

9、理組(P<0.05)。
　　4)亞砷酸對(duì)胞內(nèi)ROS的影響:實(shí)驗(yàn)組作用1、2 h后,細(xì)胞內(nèi)的ROS呈逐步增加,與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),實(shí)驗(yàn)組各濃度亞砷酸處理后細(xì)胞內(nèi)的ROS峰出現(xiàn)有意義的向右移的趨勢(shì)(P<0.05)。作用1、2 h后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)的ROS增加大于對(duì)應(yīng)預(yù)處理組(P<0.05)。
　　5)亞砷酸對(duì)△ψm的影響:實(shí)驗(yàn)組作用3、6、12 h后,各組△ψm與對(duì)照組比較均明顯減少(P<0.01),各亞砷酸

10、濃度處理后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)的△ψm峰出現(xiàn)有意義的向左移的趨勢(shì)(P<0.05)。作用3、6、12 h后實(shí)驗(yàn)組△ψm降低大于對(duì)應(yīng)預(yù)處理組(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1)亞砷酸注射液能抑制肝癌 Mahlavu細(xì)胞的增殖。在一定作用時(shí)間和藥物濃度范圍內(nèi),其增殖抑制程度隨藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)和濃度增加而增強(qiáng)。CAT能夠減弱亞砷酸對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用。
　　2)亞砷酸注射液有誘導(dǎo)肝癌Mahlavu細(xì)胞凋亡作用。CAT能夠減弱亞砷酸