1、目的:在小型豬自體腎移植模型中探究短效Caspase-3小干擾RNA(smallinterfering ribonucleic acid，siRNA)在體內(nèi)外研究中實驗結(jié)果相悖的機制，迸一步探討短效Caspase-3 siRNA對凋亡通路蛋白caspase-3活化的影響，闡明短效Caspase-3 siRNA的激活固有免疫反應機制，為其臨床轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)與實驗基礎(chǔ)。
　　方法:選擇25-30kg雄性廣西巴馬小型豬12只，隨機分為

2、I/R組6只(I/R)，Caspase-3 siRNA組6只（IR+siRNA）。建立小型豬原位自體腎移植模型，根據(jù)前期研究，左腎切取后siRNA組應用預配40ml UW器官保存液+0.3mg短效Caspase-3 siRNA（合成序列5'-GGGAGACCUUCACAAACUUtt-3'與5'-AAGUUUGUGAAGGUCUCCCtg-3'）加壓灌注，I/R組應用UW器官保存液同樣加壓灌注，冷藏24小時，移植前留取冷藏后腎臟穿刺標本

3、，再移植到右腎原位。各組于缺血再灌注后48h切取腎臟組織標本。應用real time PCR檢測各組腎臟組織中Caspase-3 mRNA及Toll樣受體信號通路下游相關(guān)炎性因子的mRNA相對載量，應用western blot檢測各實驗組小型豬腎組織中前體Caspase-3、活化型Caspase-3的表達水平。應用western blot方法檢測各組腎組織中TLR-3、TLR-7、 TRIF、MyD88、PKR、RIG-1、HMGB1蛋

4、白的表達水平。
　　結(jié)果:自體腎移植48小時后，IR+siRNA組腎臟組織內(nèi)TLR-3、TLR-7、MyD88、TRIF、PKR蛋白含量均較IR組有顯著上升，半定量結(jié)果具有統(tǒng)計學差異;IR+siRNA組腎臟組織中，Toll樣受體信號通路下游相關(guān)炎性細胞因子mRNA水平較IR組有明顯升高，結(jié)果具有統(tǒng)計學差異;免疫印跡法檢測Caspase-3蛋白載量，半定量結(jié)果顯示:移植前穿刺標本，siRNA組較I/R組Caspase-3蛋白載量明顯

5、減少（吸光度OD值1.02±0.24 vs.2.32±0.28，p＜0.01），但移植后48h腎臟標本，siRNA組較I/R組Caspase-3的17kD活性裂解片段明顯增多（OD值:0.22±0.04 vs.0.06±0.01，p＜0.05）。移植后48小時，IR+siRNA組腎臟組織標本中HMGB1的蛋白載量顯著高于IR組，半定量結(jié)果具有統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論:本研究中應用的人工合成的siRNA能有效沉默局部Caspase-3

6、 mRNA轉(zhuǎn)錄Caspase-3蛋白，在冷保存過程中有效減少細胞凋亡，但移植后腎臟的損傷反而有所增加，凋亡細胞增多，活性Caspase-3裂解片段水平上升;造成這一結(jié)果的主要原因是由Toll樣受體系統(tǒng)識別外源性siRNA，觸發(fā)啟動了機體的系統(tǒng)性炎癥反應，增強了局部組織的炎性損傷與細胞凋亡;這一損傷作用能夠持續(xù)至48小時，可能的機制為負反饋循環(huán)作用以及HMGB1蛋白參與了后續(xù)的循環(huán)級聯(lián)放大炎癥反應及細胞凋亡過程;siRNA療法作為新型干預