1、韌帶重建是目前骨科學領域的重要課題，自體韌帶移植、同種異體韌帶移植及人工材料等韌帶重建手術均存在如增加創(chuàng)傷、免疫排斥及效果不佳等問題。而隨著近年來組織工程的飛速發(fā)展，為肌腱和韌帶的修復提供了新的思路，尤其是種子細胞、生長因子、轉基因、支架材料以及體外生物反應器的不斷發(fā)展，使組織工程韌帶具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，以期解決目前肌腱和韌帶修復術中產生的一系列問題。而在組織工程韌帶的構建過程中種子細胞的選擇和轉化尤為重要，雖然支架可以提供暫時的機械支

2、持，但組織工程韌帶的長期有效性取決于種子細胞產生韌帶細胞外基質的能力，因此種子細胞的選擇和改造將影響到組織工程韌帶最終的結果，這也是組織工程的關鍵。 骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潛能，是目前組織工程中最常用的種子細胞之一，具有擴增容易、取材方便、細胞粘附性能優(yōu)良等特點。雖然骨髓間充質干細胞在韌帶組織工程中已得到較廣泛的應用，但直到

3、目前尚無比較明確的使其向韌帶成纖維細胞方向轉化的誘導技術。堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)具有明顯的促細胞生長和誘導血管生成作用，最近研究還發(fā)現成纖維細胞生長因子家族還在肌腱和韌帶的早期發(fā)育過程中發(fā)揮關鍵作用，而骨形態(tài)發(fā)生蛋白12(bone morphogenetic protein12，BMP12)是目前發(fā)現的與韌帶形成和發(fā)育最關鍵的因子，兩種細胞因子的聯合應用不僅可以充

4、分發(fā)揮韌帶成纖維細胞誘導作用，還具有促進細胞增殖和誘導血管形成的功能。我們的前期研究結果顯示攜帶bFGF基因的重組腺病毒轉染BMSCs后，細胞增殖能力得到顯著增強，但細胞形態(tài)的轉變和韌帶特異性細胞外基質的表達尚不理想，在本課題中，我們即通過腺病毒將兩種細胞生長因子高效轉染兔BMSCs，觀察兩種因子對BMSCs向韌帶成纖維細胞(Ligament Fibroblast，LF)分化的影響，探索一種優(yōu)良的韌帶組織工程種子細胞。 1、分離

5、、培養(yǎng)兔BMSCs和LF，并對兩種細胞進行分子生物學鑒別 分別通過Percoll密度梯度離心法和組織塊培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)兔BMSCs和髕韌帶LF。MTT法檢測兩種細胞的增殖活性，通過HE染色、堿性磷酸酶染色、透射電鏡及掃描電鏡等觀察兩種細胞的生物學特征，為兩種細胞的鑒定提供細胞學和形態(tài)學基礎。流式細胞儀檢測細胞表面標志物CD29、CD44、CD45及HLA-DR在兩種細胞中的表達。熒光免疫組化分析Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅴ型膠原、腱糖

6、蛋白-C、纖維連接蛋白和波形蛋白在兔BMSCs及LF細胞中的表達差異，最后對Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅴ型膠原、腱糖蛋白-C、纖維連接蛋白、波形蛋白以及seleraxis在兩種細胞中的mRNA表達進行RT-PCR分析。 2、分別構建攜帶人BMP12和bFGF基因的重組腺病毒 通過BMP12基因(NM182828)特異引物從人胎盤組織中擴增和分離純化BMP12基因CDS序列，正向引物(帶SalⅠ位點)：CGCGTCGACATGG

7、ACCTGAGCGCCGCCGC；反向引物(帶HindⅢ位點)：CCAAGCTTCCTGCAGCCGCAGGCCTCCAC，并構建重組質粒pShuttleCMV．BMP12-eGFP。將重組質粒pShuttleCMV．BMP12-eGFP通過第二代腺病毒載體AdEasyTM系統構建Ad．BMP12-eGFP重組腺病毒，并進行鑒定和擴增，同時擴增Ad．bFGF-eGFP重組腺病毒(長征醫(yī)院朱巍博士饋贈)，其中eGFP熒光蛋白為報告基因。通

8、過流式細胞儀檢測腺病毒轉染效率，同時測定腺病毒濃度和體外轉染的安全性。最后通過免疫組化鑒定構建的重組腺病毒轉染細胞后BMP12和bFGF蛋白的表達，并通過熒光顯微鏡觀察轉染后BMP12和bFGF蛋白在BMSCs內持續(xù)表達的時間。 3、觀察bFGF和BMP12基因聯合轉染后BMSCs向LF分化的作用 將BMSCs隨機分為三組，即對照組、Ad．bFGF-eGFP單獨轉染組和Ad．bFGF-eGFP及Ad．BMP12-eGFP

9、共轉染組，于37℃、5％CO2孵箱中體外培養(yǎng)。分別以MOI值100轉染BMSCs后，相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化，用MTT法檢測三組細胞的增殖活性，堿性磷酸酶染色、透射電鏡及掃描電鏡觀察三組細胞的生物學特征。Western-blot半定量分析三組細胞第7天和第14天時細胞內Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅴ型膠原、腱糖蛋白-C、纖維連接蛋白和波形蛋白在蛋白水平的表達水平。用RT-PCR方法檢測三組細胞內Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅴ型膠原、腱糖

10、蛋白-C、纖維連接蛋白、波形蛋白、轉化生長因子β1、二聚糖、核心蛋白多糖以及scleraxis mRNA在第7天和第14天時的表達水平。 1、分離培養(yǎng)的BMSCs與LF在大體形態(tài)學上相似，均表現為長梭形、漩渦狀生長，但二者在細胞的超微結構、增殖特性、細胞表型、細胞分子生物學水平上均有顯著差異。MTT檢測結果顯示BMSCs的增殖活性明顯優(yōu)于LF。透射電鏡和掃描電鏡結果顯示LF較BMSCs具有更豐富的微絨毛結構和細胞間纖維連接。流式

11、細胞儀檢測結果顯示BMSCs CD29和CD44表達陽性，陽性細胞百分率分別為96.35±3.62％和36.12±2.79％，CD45和HLA-DR表達陰性，LF除HLA-DR表達弱陽性外(8.14±1.21％)，CD29、CD44、CD45均為陰性表達。熒光免疫組化和RT-PCR分析結果表明，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅴ型膠原、纖維連接蛋白和腱糖蛋白-C在LF中的表達均強于BMSCs，而波形蛋白的表達則較BMSCs弱。RT-PCR分析結果還

12、表明Scleraxis因子陽性表達于LF，而在BMSCs中表達陰性。兩種細胞的堿性磷酸酶染色均為陰性。 2、成功構建了攜帶人BMP12基因的質粒pShuttleCMV．BMP12-eGFP，對重組質粒進行PCR鑒定和基因測序表明成功合成和整合了人BMP12基因。將重組質粒pShuttleCMV．BMP12-eGFP通過第二代腺病毒載體AdEasyTM系統成功構建了重組腺病毒Ad．BMP12-eGFP，對其再次進行PCR檢測確定本

13、實驗構建的重組腺病毒Ad．BMP12-eGFP包含目的基因BMP12。通過在293細胞內的四代擴增，我們得到了高滴度的Ad．BMP12-eGFP以及Ad．bFGF-eGFP病毒，分別約為2.5×109pfu/ml和2×109pfu/ml。通過對Ad．BMP12-eGFP和Ad．bFGF-eGFP病毒轉染Hela細胞的體外安全性實驗，證明重組腺病毒純度高、毒性低，滿足體外和體內實驗的標準。將Ad．BMP12-eGFP和Ad．bFGF-eG

14、FP病毒轉染BMSCs后，通過熒光顯微鏡和免疫組化的方法可以觀察到BMP12蛋白和bFGF蛋白的成功表達，并可在BMSCs內持續(xù)表達8周以上。 3、通過對陰性對照組、Ad．bFGF-eGFP單獨轉染組以及Ad．bFGF-eGFP和Ad．BMP12-eGFP共轉染組的細胞進行比較性分析后，結果顯示bFGF基因和BMP12基因共同轉染組的BMSCs在大體形態(tài)學和細胞的超微結構上均較對照組和bFGF基因單獨轉染組更接近LF的特征。bF

15、GF基因單獨轉染BMSCs后能明顯促進細胞的增殖，并能不同程度增強韌帶特異性細胞外基質在基因水平及蛋白水平的表達。而bFGF基因和BMP12基因共同轉染組的BMSCs增殖能力不但明顯增強，其膠原分泌能力、蛋白多糖的表達亦明顯優(yōu)于對照組和bFGF基因單獨轉染組，尤其是明顯促進了韌帶成纖維細胞特異性分化標志Tenascin-C的表達，并成功誘導了Scleraxis因子在BMSCs中的表達。三組細胞Ⅱ型膠原表達均為陰性，堿性磷酸酶的表達也無明

16、顯變化。 1、成功分離培養(yǎng)獲得兔BMSCs和LF，兩種細胞雖然在大體形態(tài)學上相似，但在細胞的超微結構、增殖特性、細胞表型、細胞分子生物學水平上均有顯著差異。 2、成功構建了攜帶人BMP12基因和bFGF基因的缺陷型重組腺病毒，體外研究證實其成功整合了人BMP12基因和bFGF基因并表達BMP12蛋白和bFGF蛋白，并同時具有滴度高、毒性低、轉染效率高的特點。 3、體外研究證實，Ad．bFGF-eGFP和Ad．BM

17、P12-eGFP以MOI100轉染BMSCs后，可在體外持續(xù)表達8周以上的時間，達到組織工程研究的要求。 4、bFGF基因單獨轉染。BMSCs后能明顯促進細胞的增殖，并能不同程度增強韌帶特異性細胞外基質在基因水平及蛋白水平的表達，但不能誘導韌帶成纖維細胞特異性分化標志Scleraxis的表達。 5、bFGF基因和BMP12基因共同轉染組的BMSCs增殖能力不但明顯增強，其膠原分泌能力、蛋白多糖的表達亦明顯優(yōu)于bFGF基因