1、大面積骨缺損是臨床上包括骨科、口腔頜面外科及整形外科領域的一大難題。骨形成蛋白一2(BMP一2)是眾多調控成骨細胞分化最重要的生理性介導因子之一，也是經FDA認證可以用于臨床治療的蛋白質，但是BMP一2體內應用容易降解，治療有效濃度難以控制，目前的骨移植和替代物移植治療均有一定局限，而exvivo基因治療可以解決這些問題。皮膚成纖維細胞因為易于獲得，數量大，易擴增及參與骨折自然愈合過程等原因被我們作為攜帶BMP一2基因的基因遞送細胞。

2、 我們首先用逆轉錄病毒載體系統將BMP一2轉入人皮膚成纖維細胞(HDFs)，通過RT-PCR和BMP一2免疫組化法在mRNA水平和蛋白水平均能檢測到BMP一2在HDFs有效表達；通過化學熒光和染色法檢測發(fā)現早期成骨表型ALP升高；體外培養(yǎng)細胞經β—GP，Dx等誘導培養(yǎng)28d后ELISA檢測到晚期成骨表型OCN分泌逐漸增加；茜素紅染色發(fā)現礦化結節(jié)增多。表明成纖維細胞經BMP一2修飾在體外能分化為成骨細胞。 然后我們將逆轉錄病

3、毒轉導BMP一2修飾的異種人皮膚成纖維細胞注射入裸鼠肌肉，注射后6周X線檢測發(fā)現有異位骨形成，組織學檢測發(fā)現HDFs能表達BMP-2并通過軟骨內成骨方式成骨，這些細胞經alu原位雜交顯示為人源性；將BMP-2修飾的同種F344大鼠皮膚成纖維細胞(FDFs)移植到異體F344大鼠顱骨缺損部位，10周后BMP-2側有近72％缺損面積被修復，而空載體側只有17％修復；將BMP-2修飾的自體同基因型皮膚成纖維細胞(SDFs)移植入SD大鼠顱骨缺

4、損后10周，BMP-2修復面積明顯大于對照側，但是比同種異體細胞移植差異小。表明BMP-2基因修飾的成纖維細胞在體內能促進骨缺損的愈合。同時發(fā)現逆轉錄病毒載體在體內有成瘤的可能。 同期進行的非病毒載體介導的BMP-2基因治療由于轉染效率低，時間短，體外成骨表型弱，體內不能成骨；而I型膠原蛋白α2(COLlA2)基因增強子和啟動子能使轉基因表達增強，并具有成纖維細胞特異性，因此本研究將COL1A2增強子、啟動子(簡稱細胞特異性元件

5、)及BMP-2基因導入pcDNA3質粒中構建pcDNA3-CEP-BMP-2，用脂質體法轉入HDFs，將血管內皮細胞(VEC)作為對照，RT-PCR檢測發(fā)現轉染含細胞特異性元件的pcDNA3-CEP-BMP-2在HDFs造成BMP-2表達高于pcDNA3-BMP-2，而VEC的BMP-2表達不增高，ELISA在蛋白水平證實這一結果；通過上述方法檢測發(fā)現轉染含細胞特異性元件的pcDNA3-CEP-BMP-2后，HDFs堿性磷酸酶活性、骨鈣

6、素的分泌和礦化能力高于pcDNA3-BMP-2，將含細胞特異性元件的pcDNA3-CEP-BMP-2轉染的HDFs注射入裸鼠體內8周后能形成骨，而pcDNA3-BMP-2只能形成軟骨。 本研究證明，通過逆轉錄病毒載體系統和成纖維細胞特異表達的新型非病毒載體轉導BMP-2基因的成纖維細胞能促進骨缺損修復，但是逆轉錄病毒轉導BMP-2的能力高于成纖維細胞特異表達的載體。此項研究將為局部基因治療骨修復的臨床應用提供新的思路和解決方法。