1、背景和目的： IgA腎病(IgAnephropathy，IgAN)是以反復(fù)發(fā)作性肉眼或鏡下血尿，腎小球系膜細(xì)胞增生，基質(zhì)增多，球囊基底膜變形、裂解伴廣泛IgA沉積為特點(diǎn)的原發(fā)性腎小球疾病，是我國慢性腎小球腎炎中最常見的一種類型，約25％的患者在確診IgAN后5年～25年內(nèi)發(fā)展為終末期腎臟疾病(endstagerenaldisease，ESRD)。迄今為止，本病尚無滿意的治療方案，治療仍定位在糖皮質(zhì)激素、環(huán)磷酰胺、雷公藤多甙、AC

2、EI等非特異性治療上，因此研究新的抑制IgA沉積，促進(jìn)腎小球功能恢復(fù)的治療方法是迫切需要解決的問題。近幾年研究結(jié)果提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)移植可能是一種很有潛力的治療腎病疾病的方法。BMSCs是存在于骨髓中的一類成體干細(xì)胞，具有易獲得、易培養(yǎng)、可以跨胚層分化、能在宿主體內(nèi)長期存活、易于攜帶外源基因和長期表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)BMSCs具有向腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞分化的潛能，

3、可以參與腎臟損傷后的再生和修復(fù)，具有保護(hù)腎臟，改善腎功能的作用。 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(bonemorphogeneticprotein-7，BMP-7)是TGF-β超家族成員之一，不僅能促進(jìn)胚胎后腎間質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，而且還可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的分化和發(fā)育，拮抗TGF-β對系膜細(xì)胞的刺激作用，減少系膜基質(zhì)的增多，具有抗炎、抗纖維化等特點(diǎn)，在維持正常腎臟功能，抑制腎小球和腎間質(zhì)纖維化中具有重要作用。 因

4、此，本研究以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能否應(yīng)用于IgA腎病的治療以及BMP-7基因修飾的BMSCs移植是否更有治療潛力為研究目的，建立IgA腎病模型，選擇BMP-7作為治療基因，GFP作為報(bào)告基因，將攜帶GFP或BMP-7基因的BMSCs移植入IgAN鼠體內(nèi)，觀察BMSCs在腎臟的分布、分化及改善腎功能的情況，觀察和評價(jià)BMP-7基因修飾的BMSCs移植是否更有利于腎功能恢復(fù)，為探討IgA腎病新的治療手段提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：

5、 1.用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法分離培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀和免疫細(xì)胞化學(xué)方法對細(xì)胞表型進(jìn)行鑒定，同時(shí)對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)分化，采用堿性磷酸酶、茜素紅及油紅O染色觀察BMSCs誘導(dǎo)分化情況。 2.采用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAAV-BMP-7。采用磷酸鈣沉淀法，重組質(zhì)?；騪AAV-GFP與pAAV-RC、pHelper共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，產(chǎn)生具有傳染性的病毒顆粒。將

6、此病毒顆粒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)方法及熒光顯微鏡觀察BMSCs表達(dá)BMP-7及GFP的情況。 3.建立小鼠IgA腎病模型，隨機(jī)分為模型組，GFP移植組及BMP-7移植組。將轉(zhuǎn)染GFP或BMP-7基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過尾靜脈移植入IgA腎病鼠體內(nèi)，分別于移植后第7d、21d、56d處死小鼠，采用免疫組化和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察BMSCs在腎臟的分布情況，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察GFP陽性的BMSCs表達(dá)desm

7、in及CD31情況；采用Westemblot方法觀察BMP-7基因修飾的BMSCs移植后腎臟是否有更多的BMP-7蛋白表達(dá)；通過血液、尿液生化及病理切片分析BMSCs移植后腎臟恢復(fù)情況，以及攜帶BMP-7基因的BMSCs移植是否比單純BMSCs移植更有利于IgA腎病腎功能的恢復(fù)。 結(jié)果： 1.小鼠原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈集落樣生長，細(xì)胞形態(tài)呈梭形，傳代后細(xì)胞生長迅速，形態(tài)比較均一，大部分細(xì)胞為成纖維樣或多角形；流式細(xì)胞儀檢

8、測結(jié)果顯示，細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD166，不表達(dá)CD34、CD45；免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示BMSCs明顯表達(dá)vimentin(間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白)，不表達(dá)E-cadherin(上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白)；BMSCs在特定誘導(dǎo)條件下可以向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化，在加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基第14d，細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽性，隨著時(shí)間的延長，可見圓形或卵圓形礦化結(jié)節(jié)，茜素紅染色呈紅色；加入成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基2w后，細(xì)胞內(nèi)可見多個(gè)折光性強(qiáng)

9、的圓形脂肪滴，油紅O染色呈紅色。 2.重組腺相關(guān)病毒rAAV-GFP和rAAV-BMP-7被成功包裝和產(chǎn)生，經(jīng)純化后滴度達(dá)到3-4×1010IU/ml以上；轉(zhuǎn)染BMSCs后，經(jīng)熒光顯微鏡及免疫組化觀察證實(shí)了GFP或BMP-7在BMSCs中的表達(dá)，轉(zhuǎn)染率在70％左右。 3.使用飲食BSA和注射細(xì)菌毒素SEB復(fù)合造模的方法，建立了小鼠IgA腎病模型，表現(xiàn)為出現(xiàn)蛋白尿，免疫熒光顯示腎小球系膜區(qū)有線狀或團(tuán)塊狀I(lǐng)gA免疫復(fù)合物沉積

10、，腎臟病理可見腎小球腫脹，體積增大，系膜彌漫性增生。 4.將攜帶GFP基因的BMSCs移植入IgA腎病鼠體內(nèi)后7d，激光掃描共聚焦顯微鏡顯示腎小球及其周圍可見少量GFP陽性細(xì)胞，移植后56d，腎小球內(nèi)GFP陽性細(xì)胞明顯增多，并且在小球周圍、腎間質(zhì)及包膜下均可見呈現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞；免疫細(xì)胞化學(xué)顯示部分GFP陽性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)desmin或CD31；攜帶BMP-7基因的BMSCs移植入IgA腎病鼠體內(nèi)后，免疫組化結(jié)果顯示腎小球內(nèi)可見少

11、量BMP-7陽性細(xì)胞，Westernblot結(jié)果顯示隨著移植時(shí)間的延長，腎臟表達(dá)BMP-7蛋白量明顯增多，并且同時(shí)相點(diǎn)，BMP-7移植組BMP-7蛋白量較GFP移植組高：腎臟病理切片免疫熒光顯示移植BMSCs后，沉積在腎小球系膜區(qū)的IgA明顯減少：血液及尿液生化分析表明移植BMSCs后，小鼠血清肌酐、尿素氮及24h尿蛋白量明顯降低，移植后56d，BMP-7移植組小鼠肌酐、尿素氮及24h尿蛋白量較GFP移植組下降明顯。 結(jié)論：

12、 1.利用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法，可以獲得較高純度的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，這些細(xì)胞具有典型的間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞表型，在特定誘導(dǎo)條件下可以向脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞分化。 2.成功構(gòu)建重組腺相關(guān)病毒rAAV-BMP-7和rAAV-GFP，經(jīng)純化后病毒滴度達(dá)到3-4×1010IU/ml，該病毒可以高效轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，所攜帶的目的基因可以在BMSCs中長期穩(wěn)定表達(dá)。 3.經(jīng)靜脈途徑植入的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在