1、中南大學(xué)博士學(xué)位論文bFGF基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究姓名：楊杰申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師：楊期東20050501胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)，鑒定誘導(dǎo)后的細(xì)胞分化類型，并觀察其變化規(guī)律。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將外源性b F G F 轉(zhuǎn)入M s c s 中，并用I Ⅱ一P c R 、免疫細(xì)胞化學(xué)和w e s t e mb l o t 方法檢測(cè)b F G F 在轉(zhuǎn)染后的M S C s 中的分泌表達(dá)情況。最后，將M S

2、C s 和b F G F 基因修飾的M S c s ( M s C s - b F G F )通過靜脈移植至實(shí)驗(yàn)性腦缺血大鼠體內(nèi)，觀察比較兩者對(duì)大鼠腦缺血后神經(jīng)功能及腦梗死體積的影響，并應(yīng)用免疫組化、雙重?zé)晒鈽?biāo)記方法觀察M S C s 在腦內(nèi)遷移和分化情況。結(jié)果：第6 代M s c s 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原，結(jié)果顯示C D 2 9 、c D l 0 6 、c D 4 5 和C D 3 4 的表達(dá)分別為：9 2 。5 2 ％、9

3、2 ．7 7 ％，、6 ．2 6 ％和5 ．4 9 ％。誘導(dǎo)分化后的M s c s 早期巢蛋白( N e s t i n ) 明顯增高，l h 和3 h 陽性率分別為：3 5 ．1 8 ±1 ．3 2 ％和3 8 ．7 5 ±2 ．4 6 ％，5h 后表達(dá)逐漸降低。神經(jīng)元特異性烯醇化酶( N s E ) 5h 為7 7 ．5 2 士3 ．6 5 ％，2 4h 為8 6 ．3 7 士1 ．2 6 ％，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(

4、 G F A P ) 呈低水平表達(dá)。轉(zhuǎn)染了p E G F P —c 2 質(zhì)粒的M S c s 培養(yǎng)2 4 h 后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示綠色熒光蛋白( G F P ) 陽性率為2 5 ．7 8 ％。轉(zhuǎn)染了p c D N A 3 ．1 ．b F G F 的M s c s 的R N A 可擴(kuò)增出大小為3 7 5b p 的b F G F 目的基因片斷，同時(shí)在細(xì)胞中及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到b F G F 蛋白的表達(dá)。通過靜脈移植M s C s

5、 和M s c s _ b F G F 后發(fā)現(xiàn)，兩者均能改善腦缺血后大鼠的神經(jīng)功能、減少腦梗死體積，且M S c s ．b F G F 的作用明顯優(yōu)于M S C s ，免疫組化和熒光雙標(biāo)顯示M s C s - b F G F 治療組大鼠腦內(nèi)B r d u 陽性細(xì)胞和B r d u ．N e u N 雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于M s c s 治療組大鼠，而B r d u ．G F A P 雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)兩組間無顯著差異。結(jié)論：1 ．M S c