1、目的:
　　建立自由落體致顱腦損傷 SD大鼠模型,探討創(chuàng)傷后腦損傷 TBI抵抗素基因表達的特征及其對創(chuàng)傷后胰島素敏感性的影響作用。
　　方法:
　　清潔級 SD(Spruge-Dawley)雄性大鼠216只,體重300～350g。計算機編號隨機抽取方法均分為6組:正常對照組,假手術(shù)組,輕度損傷組,重度損傷組,外源性磷酸脂多糖(LPS)注射組,RSTN抗體注射組。每組36只。大鼠用10％水合氯醛(0.35g/kg體重)腹

2、腔內(nèi)注射麻醉后,固定于立體定向儀消毒并切開頭皮(沿中線偏左側(cè))分離骨膜,于緊挨冠狀縫后中線旁2mm用牙科電鉆開一直徑5mm的圓形窗,硬膜保持完整。采用自制改進型 Feeney自由落體創(chuàng)傷性腦損傷裝置造成大鼠左頂葉局限性腦損傷:用20g砝碼于10cm處通過一金屬導(dǎo)桿墜落,撞擊置于硬膜上的圓錐上致輕型損傷,另用40g砝碼于25cm高處墜落致重型損傷。外源性磷酸脂多糖(LPS)注射組(以下簡稱 LPS組)用10％水合氯醛(0.35g/kg體重

3、)腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠后,將其頭部固定于立體定向儀上,以前囟為零點值,于前囟后5mm,中線左側(cè)4mm處,用牙科電鉆鉆開顱骨,切開硬腦膜,用微量注射器自大腦表面進針(垂直)1.8mm,緩慢注射5ul LPS溶液(25ug),留針2min,緩慢拔針,縫合皮膚,松解大鼠,待其自然蘇醒。RSTN抗體注射組(以下簡稱 RSTN組)取重度損傷組大鼠,按1mg/只劑量腹腔注射。正常對照組(以下簡稱正組)不做任何處理。假手術(shù)組(以下簡稱假組)僅切開頭皮和

4、顱骨開窗,不致腦損傷。對重度損傷組和RSTN組于術(shù)后24小時,1周,4周應(yīng)用Longa評分法進行神經(jīng)行為學(xué)評分。各組均于術(shù)后12小時,24小時,72小時,1周,2周,4周尾靜脈采血,供 ELISA法檢測血糖,血清胰島素,血清抵抗素并以?ln(血糖) FINS FPG(×(胰島素))計算定量胰島素敏感性檢測指數(shù)( QUICKI),同時處死大鼠,取同側(cè)和對側(cè)海馬、下丘腦、皮層組織,供逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測抵抗素 mRN

5、A及Western blot法檢測抵抗素蛋白的表達。
　　結(jié)果:
　　(1)血清抵抗素濃度在正常組和假手術(shù)組各時間點之間均沒有顯著差異(各P均>0.05)。以假手術(shù)組為基準(zhǔn),輕度損傷組、重度損傷組、LPS組和RSTN組在建模成功后的各個檢測時點(12h、24h、72h、1w、2w和4w)均出現(xiàn)血清抵抗素水平的顯著升高(各 P均<0.05);各組平均血清抵抗素濃度:重度損傷組>RSTN組>LPS組>輕度損傷組>假手術(shù)組(各 P

6、均<0.05)。組內(nèi)血清抵抗素隨時間的變化趨勢:輕度損傷組與重度損傷組均于12h出現(xiàn)升高,持續(xù)升高至4w達到峰值(各P均<0.05)。LPS注射組在12h開始升高,72h達到峰值,到1w時出現(xiàn)下降,持續(xù)下降到4w(各 P均<0.05); RSTN組12h升高至重度損傷組水平(P>0.05),24h時出現(xiàn)下降,72h時又出現(xiàn)升高,持續(xù)升高至4w達到峰值(各 P均<0.05)。比較重度損傷組和RSTN組血清抵抗素濃度發(fā)現(xiàn)兩者差異最大的時點出

7、現(xiàn)在2w:RSTN組均值較重度損傷組下降了53.4％(P<0.05)。
　　(2)Resistin的表達(mRNA和蛋白)在正常組和假手術(shù)組之間沒有顯著差異(P>0.05)。抵抗素在腦內(nèi)不同組織(海馬、下丘腦、皮層)中呈現(xiàn)表達隨時間變化趨勢一致的有:以假手術(shù)組為基準(zhǔn),輕度損傷組到4w才開始出現(xiàn)表達量顯著提高(P<0.05)。重度損傷組在12小時表達量就升高,一直到4w持續(xù)升高表達(各P均<0.05)。LPS組在12小時表達量就升高

8、,一直到1w持續(xù)升高表達,到2w開始表達量下降并持續(xù)下降到4w(各 P均<0.05)。RSTN注射組在12小時表達量就升高,一直到4w持續(xù)升高表達(各 P均<0.05)。抵抗素在腦內(nèi)不同組織中呈現(xiàn)表達隨時間的變化趨勢不一致的為:重度損傷組和RSTN組的皮層部位 mRNA的表達在4w時均呈現(xiàn)下降的趨勢(各 P均<0.05)。與基準(zhǔn)值相比,各部位能檢測到的Resistin有統(tǒng)計學(xué)意義的表達升高在損傷同側(cè)組織中均顯著高于對側(cè)(各 P均<0.0

9、5)。在本研究涉及的檢測部位海馬、下丘腦和皮層中,抵抗素表達量的升高以海馬部位最明顯,其次依次是皮層和下丘腦(P<0.05)。比較重度損傷組和RSTN組之間各時點抵抗素 mRNA的表達量均為重度損傷組>RSTN組,但兩者差異最大的時點出現(xiàn)在4w:RSTN組較重度損傷組下降了77.5％,不過與1w時點的下降74.3％無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),兩者差異最小的時點出現(xiàn)在24h:RSTN組較重度損傷組下降了60.3％,與上述時點間差異有統(tǒng)計

10、學(xué)意義(P<0.05)。
　　(3)血糖和血清胰島素濃度在正常組和假手術(shù)組各時間點之間均沒有顯著差異(各 P均>0.05)。以假手術(shù)組為基準(zhǔn),輕度損傷組在12h、24h、72h顯著升高(各P均<0.05);重度損傷組在12h、24h、72h、1w、2w、4w顯著升高(各 P均<0.05);LPS組在12h、24h顯著升高(各 P均<0.05);RSTN組在12h、72h、1w、2w、4w顯著升高(各 P均<0.05)。各組平均血糖

11、和血清胰島素濃度:重度損傷組>RSTN組>LPS組>輕度損傷組>假手術(shù)組(各 P均<0.05)。組內(nèi)血糖和血清胰島素隨時間的變化趨勢:輕度損傷組12h開始升高,24h達到峰值,72h出現(xiàn)下降(各 P均<0.05),到1w時降至假手術(shù)組水平(P>0.05)。重度損傷組12h開始升高,持續(xù)升高至1w達到峰值,2w時下降一直到4w時仍未恢復(fù)到假手術(shù)組水平(各 P均<0.05);LPS注射組在12h開始升高,24h達到峰值(各 P均<0.05)

12、,72h已降至假手術(shù)組水平(P>0.05); RSTN組12h升高至重度損傷組水平(P>0.05),24h時出現(xiàn)下降,72h時又出現(xiàn)升高,到1w時達到峰值,隨后有所下降,持續(xù)降到4w時仍未恢復(fù)到假手術(shù)組水平(P均<0.05)。
　　(4)根據(jù)血糖和血清胰島素濃度以公式法計算獲得的QUICKI來表示的胰島素敏感指數(shù):同樣,QUICKI在正常組和假手術(shù)組各時間點之間均沒有顯著差異(各P均>0.05)。以假手術(shù)組為基準(zhǔn),輕度損傷組在12

13、h、24h、72h顯著降低(各 P均<0.05);重度損傷組在12h、24h、72h、1w、2w、4w顯著降低(各 P均<0.05);LPS組在12h、24h顯著降低(各 P均<0.05);RSTN組在12h、72h、1w、2w、4w顯著降低(各 P均<0.05)。平均組間 QUICKI在數(shù)值上比較:重度損傷組

14、降低,24h達到谷值,72h已有升高但仍低于假手術(shù)組(各 P均<0.05),到1w時已升高至假手術(shù)組水平(P>0.05)。重度損傷組12h開始降低,持續(xù)升高至1w達到谷值,2w時已有升高但仍低于假手術(shù)組,到4w時仍未恢復(fù)到假手術(shù)組水平(各 P均<0.05);LPS注射組在12h開始降低,24h達到谷值(各 P均<0.05),72h已升至假手術(shù)組水平(P>0.05); RSTN組12h降低至重度損傷組水平(P>0.05),24h時已升高,

15、但低于假手術(shù)組水平(P<0.05),72h又降低,到1w時達到谷值,隨后有所升高,持續(xù)到4w時仍未恢復(fù)到假手術(shù)組水平(各 P均<0.05)。
　　(5)所有組別(除 LPS組之外)樣本的血清抵抗素指標(biāo)與根據(jù)血糖和血清胰島素指標(biāo)計算獲得的胰島素敏感指數(shù)指標(biāo)兩者進一步做相關(guān)分析,在排除時間點的協(xié)變量因素后顯示,血清抵抗素與胰島素敏感指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.764,P=0.000<0.05)。
　　(6)將重度損傷組和RSTN

16、注射組之間進行24h、1w和4w的大鼠神經(jīng)功能評分,發(fā)現(xiàn):組間比較,重度損傷組與 RSTN組在24h,1w和4w的神經(jīng)功能評分均有統(tǒng)計學(xué)意義,重度損傷組高于 RSTN組(P<0.05);組內(nèi)分析,以假手術(shù)組的評分0為基準(zhǔn),重度損傷組在致傷后24h評分升高,1w達到峰值,隨后4w時出現(xiàn)下降(各 P均<0.05)。RSTN組趨勢相同(各 P均<0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)創(chuàng)傷性腦損傷發(fā)生后,血清抵抗素濃度在傷后12小時即

17、出現(xiàn)升高,且呈現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢直至傷后4周以上,同時升高的程度與損傷的程度有關(guān),損傷越重,升高越明顯。抵抗素在 mRNA和蛋白層面的表達也呈現(xiàn)類似于血清抵抗素的升高和變化趨勢,但存在大腦內(nèi)不同組織/器官的差異化表達,這種差異化不僅體現(xiàn)在表達量上(海馬>皮層>下丘腦,傷側(cè)>對側(cè)),還反映到表達量隨時間的變化趨勢上(皮層部位抵抗素 mRNA的表達在傷后四周時呈現(xiàn)下降的趨勢)。甚至反映為抵抗素抗體發(fā)揮拮抗抵抗素效應(yīng)作用的位點和時點上(注射抵抗

18、素抗體后,能夠在傷后2周對血清抵抗素濃度產(chǎn)生下降53.4％的拮抗效應(yīng),以及在傷后1周和4周對海馬組織內(nèi)抵抗素的表達分別產(chǎn)生下降77.5％和下降74.3％的影響)。
　　(2)創(chuàng)傷性腦損傷發(fā)生后,血糖和血清胰島素呈現(xiàn)完全一致的變化趨勢:在傷后12小時即出現(xiàn)顯著升高,升高的峰值和持續(xù)時程因損傷程度輕重而異,損傷越重,升高的峰值越高,持續(xù)升高的時程也越長,然后在1-4周內(nèi)逐漸下降,恢復(fù)或不完全恢復(fù)到致傷前水平。胰島素敏感性指數(shù)則呈現(xiàn)相反

19、的變化趨勢:即胰島素敏感性下降(胰島素抵抗)隨著 TBI的發(fā)生而出現(xiàn),最早見于傷后12h,根據(jù)傷情輕重不同,逐漸于24小時—1周內(nèi)達到谷值,然后逐漸恢復(fù),在1—4周內(nèi)恢復(fù)或不完全恢復(fù)到致傷前水平。
　　(3)經(jīng)過統(tǒng)計分析,血清抵抗素與胰島素敏感指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān),即在創(chuàng)傷性腦損傷狀態(tài)下,血清抵抗素越高,機體的胰島素敏感性越低,即機體的胰島素抵抗越強。提示抵抗素可能在創(chuàng)傷性腦損傷大鼠發(fā)生胰島素抵抗的過程中發(fā)揮重要的影響作用。推測抵抗素

20、與機體發(fā)生應(yīng)激性胰島素抵抗關(guān)系密切,TBI條件下,抵抗素發(fā)生致腦損害的機理有可能是通過影響胰島素敏感性發(fā)揮作用,兩者之間可能以影響代謝為共同手段和橋梁來引起腦損害尤其是繼發(fā)性腦損害。控制抵抗素可能是減輕腦損害的有效途徑。
　　(4)通過設(shè)立外源性脂多糖局部注射產(chǎn)生的單純炎性腦損傷作對比分析,發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷性腦損傷引起的血清抵抗素水平的變化并不能認(rèn)為僅僅是炎性反應(yīng)的結(jié)果,推測創(chuàng)傷性腦損傷的致傷機理區(qū)別于單純炎性反應(yīng)的復(fù)雜性,以及單純用抵抗