1、【背景與目的】 NPM1(Nucleophosrnin，又稱B23、Numatrin或N038)是一種主要的核仁磷酸化蛋白，與P53、P19<'ARF>及P14<'ARF>相互作用保持基因組的穩(wěn)定性，可以起到重要的腫瘤抑制作用。2005年至今多篇文獻(xiàn)報(bào)道了急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者尤其是正常核型AML患者中NPM1基因第12外顯子突變的發(fā)生率較高，成為目前AML患者中最常見的一種分

2、子遺傳學(xué)異常；且發(fā)生NPM1基因突變的AML患者具有相對(duì)特異的臨床特征，對(duì)于了解AML患者的發(fā)病機(jī)制有一定幫助。 鑒于現(xiàn)階段在國內(nèi)尚無大樣本病例的相關(guān)研究，本研究收集了大量成人AML患者的初診骨髓/外周血標(biāo)本，從以下三方面進(jìn)行研究：(1)檢測NPM1基因第12外顯子的突變在156例成人AML患者中的發(fā)生率；(2)分析NPM1基因突變陽性AML患者的臨床資料探討其臨床特征及預(yù)后；(3)對(duì)其中同時(shí)檢測了NPM1和FLT3兩種基因突變

3、情況的86例AML患者進(jìn)行綜合分析，了解這兩種基因突變發(fā)生的關(guān)系及對(duì)預(yù)后的影響。 【方法】 156例成人AMIL患者來自2005年1月～2006年4月我單位住院或門診初診病例，其中男性84例、女性72例；中位年齡48(15～73)歲。按FAB分型標(biāo)準(zhǔn)，M<,0>1例、M<,1>27例、M<,2>46例、M<,3>29例、M<,4>9例、M<,5>39例、M<,6>5例，其中正常核型AML90例，異常核型AML 66例。主

4、要研究方法為：(1)用基因組DNA-聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reactiorL，PCR)擴(kuò)增NPM1基因第12號(hào)外顯子，通過對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis，CE)的方法篩選出NPM1基因突變陽性的AML患者。對(duì)于突變的AML患者，將PCR產(chǎn)物回收純化后用pMD18-T載體做克隆測序，明確NPM1基因突變發(fā)生的位置和類型；(2)分析156例AML患者的臨床及實(shí)驗(yàn)室

5、資料了解NPM1基因突變陽性患者的臨床特征；(3)隨訪上述病例中住院患者對(duì)治療的反應(yīng)以及生存時(shí)間，了解預(yù)后；(4)采用基因組DNA-PCR法檢測其中86例AML患者的FLT3內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(internal tandem duplication，ITD)突變發(fā)生情況，綜合分析其臨床資料了解兩種基因突變發(fā)生的關(guān)系及對(duì)預(yù)后的影響。 【結(jié)果】 156例成人AML患者中共檢出44例發(fā)生了NPM1基因第12號(hào)外顯子的突變，檢出率為2

6、8.2％；其中M<,0>為1/1例(100％)、M<,1>為11/27例(40.7％)、M<,2>為11/46例(23.9％)、M<,3>為0/29例(0％)、M<,4>為2/9例(22.2％)、M<,5>為18/39例(46.2％)、M<,6>為1/5例(20.0％)。90例正常核型AML中檢出37例突變陽性患者(41.1％)，66例異常核型AML中檢出7例突變陽性患者(10.6％)，正常核型AML患者NPM1基因突變的比例高于異常核

7、型組(P<0.001)。NPMI基因突變陽性患者年齡相對(duì)較大(P<0.05)，外周血白細(xì)胞高(P<0.05)，伴有CD<,34>和CD<,117>低表達(dá)(P值均<0.05)。 對(duì)其中32例突變標(biāo)本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了5種已知的NPM1基因突變類型，即TCTG插入重復(fù)25例(25/32；78.1％)、CATG插入2例(2/32：6.3％)、CCTG插入2例(2/2；6.3％)、CCAG插入1例(1/32；3.1％)

8、和CTTG插入1例(1/32：3.1％)(分別為A、B、D、N<,M>和P<,M>突變類型)，并新發(fā)現(xiàn)了一種NPM1突變類型(CAAA插入1例，暫將其命名為S型)。突變發(fā)生的位置均在960～961位核苷酸(正常參照序列g(shù)enebank編號(hào)為NM-002500)，且均為雜合型突變。NPM1基因突變是一種移碼突變，形式多樣，但形成的突變NPM1蛋白C末端氨基酸序列均為VSLRK。 與NPM1<'->AML患者組相比，NPM1<'+>

9、AML患者組臨床完全緩解(complete remission,CR)率偏高(66.7％vs 54.8％)，總的生存時(shí)間偏長，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。NFM11<'+>AML患者組FLT3-ITD的檢出率為24.1％，是NPM1<'->AML患者組FLT3-ITD檢出率(14.1％)的1.72倍。NPM1<'+>/FLT3-ITD<'->、NPM1<'->/FLT3-ITD<'->、NPM1<'+>/FLT3-ITD<'+>、

10、NPM1<'->/FLT3-ITD<'+>組患者在86例AML患者中的檢出率分別為25.6％、56.9％、8.1％、9.3％；四組的CR率分別為66.7％、60.0％、50.0％、42.9％(P>0.05)；且在總生存時(shí)間上也無差異。 【結(jié)論】 成人AML患者中NPMI基因第12號(hào)外顯子的突變類型多樣，一般為4 bp插入的雜合型突變，并在國內(nèi)外首次報(bào)道了一種新的NPM1基因突變類型(即CAAA插入)。NPM1基因第12號(hào)

11、外顯子的突變多見于正常核型AML，F(xiàn)AB-M<,1>和M<,5>患者更為多見，突變組患者年齡較大，外周血白細(xì)胞數(shù)量高，并與CD<,34>和CD<,117>表達(dá)低水平相關(guān)。NPM1與FLT3基因突變相伴發(fā)生的幾率高，攜帶有NPM1基因突變而無FLT3-ITD突變的AML患者在臨床上CR率偏高，長期生存率高，可能是預(yù)后良好的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)檢測NPM1基因突變所用的基因組DNA-PCR方法簡單可靠，容易在各單位開展，可以用于初診AML患者的輔助