1、目的：腫瘤壞死因子(Tumornecrosisfactor，TNF)功能的發(fā)揮依賴其膜受體(TumornecrosisfactorreceptorTNFR)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)mTNFR(Membrane-boundtumornecrosisfactorreceptormTNFR)介導(dǎo)TNF的程序化死亡作用(apoptosis)、病毒感染肝細(xì)胞的清除作用以及其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，是機(jī)體殺滅清除腫瘤細(xì)胞重要的靶位點(diǎn)，在TNFR表達(dá)陰性的大

2、腸癌細(xì)胞株經(jīng)轉(zhuǎn)染TNFR基因后其細(xì)胞膜高度表達(dá)TNFR，而這種轉(zhuǎn)染細(xì)胞可被重組TNF殺傷。體內(nèi)有多種免疫活性因子(如干擾素、白介素等)即通過激活上調(diào)TNFR以達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的，這也是腫瘤免疫治療、生物治療的基礎(chǔ)，因而誘導(dǎo)并穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞膜TNFR對(duì)機(jī)體抗腫瘤作用致關(guān)重要。可溶性腫瘤壞死因子受體(Solubletumornecrosisfactorreceptor，sTNFR)來源于相應(yīng)TNFR的膜外段，可結(jié)合TNF，并以此阻止TNF

3、與細(xì)胞膜表面的TNFR結(jié)合。因此，在體內(nèi)具有重要的免疫抑制作用。sTNFR已被作為免疫抑制劑應(yīng)用于臨床如器官移植后的急性排斥反應(yīng)、關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的治療。而對(duì)腫瘤治療，則需克服免疫抑制。已有研究證實(shí)大腸癌患者體液中存在著高水平的sTNFR，其濃度與患者病情、病程及其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)系。我們的研究顯示大腸癌患者血清高水平的sTNFR主要來源于腫瘤細(xì)胞膜TNFR的脫落釋放。一方面，腫瘤細(xì)胞失去了機(jī)體免疫系統(tǒng)作用的靶位點(diǎn)；另一方面，大

4、量的sTNFR釋放入血，對(duì)機(jī)體具有強(qiáng)烈的免疫抑制作用，從而加速了患者惡液質(zhì)狀態(tài)的形成，這是腫瘤細(xì)胞針對(duì)機(jī)體主動(dòng)分泌可溶性受體分子以抵抗機(jī)體對(duì)腫瘤的殺傷作用，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的重要方式。目前腫瘤細(xì)胞釋放sTNFR的確切機(jī)理還不明了，可能和某種活性基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的酶解有關(guān)，故而通過抑制酶活性以減少sTNFR的產(chǎn)生，可能成為腫瘤治療的新手段，而金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)是基質(zhì)金屬蛋白酶主要的生理抑制劑，對(duì)活性MMPs具

5、有相對(duì)專一的抑制作用，在侵襲性腫瘤組織中MMPs的高表達(dá)程度總要高于TIMPs，正由于這種平衡被打破，導(dǎo)致了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。 本研究初步探討MMP-9對(duì)大腸癌細(xì)胞株釋放sTNFR1的促進(jìn)作用及促進(jìn)大腸癌轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。 方法：我們選擇大腸癌細(xì)胞株Lovo、SW620、SW480、SW1116，研究細(xì)胞膜表面TNFR1的表達(dá)，同時(shí)以SW1116細(xì)胞為靶細(xì)胞，觀察其經(jīng)MMP-9作用前后TNFR1表達(dá)量的變化及細(xì)胞培養(yǎng)上清中

6、sTNFR1的改變。 一、大腸癌細(xì)胞株爬片的制備及免疫熒光染色：將培養(yǎng)的大腸癌細(xì)胞株SW1116，SW620，SW480，LOVO細(xì)胞調(diào)成5×104/mL的細(xì)胞懸液，接種于24孔板中，每孔預(yù)先置入6mm×6mm蓋玻片一張，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)終止培養(yǎng)。4％多聚甲醛固定爬片后進(jìn)行免疫熒光染色。 二、大腸癌細(xì)胞株細(xì)胞膜表面TNFR1的表達(dá)的觀察：將以上制備好的細(xì)胞爬片在熒光顯微鏡下觀察，TNFR1陽性表達(dá)細(xì)胞在熒光顯微鏡下發(fā)

7、出綠色熒光。選取SW1116細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下觀察照像。 三、MMP-9對(duì)大腸癌細(xì)胞株表面TNFR1表達(dá)的影響：人SW1116大腸癌細(xì)胞以2×105/mL接種于24孔板，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h使細(xì)胞吸附在培養(yǎng)板上換用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入含有活化后MMP-9的RPMI-1640培養(yǎng)基(無血清)進(jìn)行干預(yù)，總體積為500μL。分組如下①M(fèi)MP9Ong/mL；②MMP9154ng/mL；③MMP9385

8、ng/mL；④MMP9770ng/mL；⑤MMP91155ng/mL，干預(yù)3h;或用MMP9770ng/mL干預(yù)0、1.5、3、6和9h。將以上干預(yù)前、后的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面TNFR1的表達(dá)情況，并將細(xì)胞培養(yǎng)上清用EP管分裝，-20℃冰箱凍存，以備第二部實(shí)驗(yàn)使用。 四、細(xì)胞培養(yǎng)上清中sTNFR1的表達(dá)：將第一部分MMP-9干預(yù)前后凍存的細(xì)胞培養(yǎng)上清室溫凍融，500×g離心5min后，用人sTNF-RI定量EIA試劑盒

9、檢測(cè)上清中sTNF-RI含量。 五、統(tǒng)計(jì)方法：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X±S表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件中的one-wayANOVA和LSD及線性相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果 一、大腸癌各細(xì)胞株表面表達(dá)TNFR1：熒光顯微鏡下觀察顯示FITC標(biāo)記的四株大腸癌細(xì)胞株表面均表達(dá)TNFR1；在激光共聚焦顯微鏡下可更清楚地觀察到，F(xiàn)ITC標(biāo)記的SW1116大腸癌細(xì)胞株表面表達(dá)TNFR1。 二、當(dāng)時(shí)間固定為3h，不同濃度M

10、MP-9對(duì)SW1116細(xì)胞TNFR1表達(dá)的影響：流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示TNFR1的表達(dá)，在不同的濃度MMP-9作用3h后，MMP-9Ong/mL組(表達(dá)率90.92％)；MMP-9154ng/mL組(表達(dá)率85.05％)，MMP-9385ng/mL組(表達(dá)率87.54％)，MMP-9770ng/mL組(表達(dá)率69.96％)，MMP-91155ng/mL組(表達(dá)率65.06％)。表明MMP-9對(duì)SW1116細(xì)胞表面TNFR1表達(dá)有下調(diào)作用且

11、與劑量有一定的關(guān)系。 三、MMP-9作用不同時(shí)間后對(duì)TNFR1表達(dá)的影響：在固定MMP-9770ng/mL濃度，不同作用時(shí)間條件下，0h組(表達(dá)率86.36％)，1.5h(表達(dá)率83.88％)，3h(表達(dá)率67.68％)，6h(表達(dá)率18.08％)，9h(表達(dá)率14.38％)。表明MMP-9對(duì)SW1116細(xì)胞表面TNFR1表達(dá)的下調(diào)作用與時(shí)間有一定的關(guān)系。 四、當(dāng)時(shí)間固定為3h，不同濃度的MMP-9作用后，SW1116細(xì)

12、胞培養(yǎng)上清中sTNFR1表達(dá)量的變化：ELISA定量檢測(cè)結(jié)果顯示，MMP-9Ong/mL組，sTNFR1的量為28.70pg/mL；MMP-9154ng/mL組，sTNFR1的量為33.67pg/mL；MMP-9385ng/mL組，sTNFR1的量為28.66pg/mL；MMP-9770ng/mL組，sTNFR1的量為130.23pg/mL；MMP-91155ng/mL組，sTNFR1的量為137.09pg/mL。表明MMP-9促進(jìn)SW

13、1116細(xì)胞表面TNFR1脫落形成sTNFR1且與劑量有一定的關(guān)系。 五、當(dāng)MMP-9濃度固定為770ng/mL，MMP-9作用不同時(shí)間后細(xì)胞培養(yǎng)上清中sTNFR1量的變化：ELISA定量檢測(cè)結(jié)果顯示，0h組sTNFR1的量為28.69pg/mL；1.5h組sTNFR1的量為49.34pg/mL；3h組sTNFR1的量為130.23pg/mL；6h組sTNFR1的量為176.36pg/mL；9h組sTNFR1的量為189.36p

14、g/mL。表明MMP-9促進(jìn)SW1116細(xì)胞表面TNFR1脫落形成sTNFR1且與時(shí)間有一定的關(guān)系。 六、MMP-9作用前后SW1116細(xì)胞TNFR1的表達(dá)與細(xì)胞培養(yǎng)上清中sTNFR1的關(guān)系：經(jīng)線性相關(guān)分析顯示兩者呈明顯負(fù)相關(guān) 結(jié)論 一、大腸癌細(xì)胞株表達(dá)TNFR1 二、MMP-9促進(jìn)SW1116細(xì)胞表面TNFR1脫落形成sTNFR1，但有劑量和時(shí)間依賴性。MMP-9下調(diào)大腸癌細(xì)胞表面TNFR1的表達(dá)，可能