1、研究背景和目的:血友病B是一種由于凝血因子以缺乏導(dǎo)致的嚴(yán)重出血性疾病，為X染色體連鎖隱性遺傳。主要臨床表現(xiàn)是不可預(yù)測(cè)的、反復(fù)自發(fā)性軟組織及大關(guān)節(jié)出血.臨床上乙型血友病的嚴(yán)重程度與循環(huán)中FIX(coagulation factorIX)的水平相關(guān)。目前的替代療法己經(jīng)在很大程度上降低了出血發(fā)生的頻率以及繼發(fā)的關(guān)節(jié)疾病，并大大的提高了血友病病人的生存期。但是血漿濃縮FIX可能引起傳染性疾病，而純化FIX所需費(fèi)用巨大。血友病B是很好的基因治療研

2、究模型。一般來(lái)說(shuō)，杯IX(human FIX)基因可以通過(guò)病毒或非病毒載體進(jìn)行輸送.近年來(lái)，非病毒載體的研究越來(lái)越受到重視。噬菌體整合酶phiC31可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，被應(yīng)用與基因工程包括基因治療的研究.在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，這種酶介導(dǎo)帶有attB位點(diǎn)的質(zhì)粒整合入宿主基因組中的假attP位點(diǎn)。Aneja及其同事發(fā)現(xiàn)外來(lái)質(zhì)粒與整合酶編碼質(zhì)粒共注射才能實(shí)現(xiàn)外源基因在肺臟持續(xù)表達(dá)，而單獨(dú)注射外來(lái)質(zhì)粒則不能。本研究的主要目的是通過(guò)高壓尾靜脈

3、注射把攜帶attB和hFIX的質(zhì)粒與表達(dá)phiC31的質(zhì)粒共同導(dǎo)入肝臟細(xì)胞，檢測(cè)目的質(zhì)粒能否整合入小鼠基因組并持續(xù)表達(dá)。方法:首先構(gòu)建表達(dá)hFIX并攜帶attB核心序列的真核表達(dá)載體attB-hFIX-pIRES2-EGFP并在體外驗(yàn)證該載體能否表達(dá)目的基因.然后用高壓尾靜脈注射的方法將該載體與表達(dá)戶(hù)iC31的質(zhì)粒CMV-int共注射血友病B小鼠，attB-hFIX-pIRES2-EGFP單獨(dú)注射為對(duì)照。用ELISA的方法檢測(cè)hFIX在

4、其體內(nèi)的表達(dá);用出血時(shí)間評(píng)價(jià)血友病小鼠出血癥狀是否改善;用巢式PCR檢測(cè)attB-hFIX-pIRES2-EGFP是否整合到基因組的整合熱點(diǎn)mpsLl(mouse pseudo-sitefrom liver1準(zhǔn)點(diǎn).結(jié)果:經(jīng)鑒定，atkB-hFIX-pIRES2-EGFP載體構(gòu)建成功，并在體外表達(dá)hF1Aa高壓尾靜脈注射血友病B小鼠后24小時(shí)，hFIX血清水平達(dá)到最高值，為正常水平的30％，此時(shí)小鼠的出血癥狀明顯改善。但是不論是否與CMU

5、 int共注射，此后hFIX水平迅速下降，在注射后10天內(nèi)降到本底水平。巢式PCR的結(jié)果證實(shí)，attB-hFIX-pIRES2-EGFP整合到了小鼠肝臟基因組的mpaLl位點(diǎn)。結(jié)論:phiC31可以將34bp的attB最短序列整合到小鼠基因組的整合熱點(diǎn)mpsLl;由CMV啟動(dòng)hFIX的能夠瞬間高表達(dá)并有效改善血友病小鼠的出血癥狀;但是外來(lái)DNA進(jìn)入細(xì)胞后，無(wú)論是否整合到基因組均被迅速沉默，說(shuō)明肺臟和肝臟對(duì)整合入基因組的C州rV啟動(dòng)子表達(dá)

6、調(diào)控的機(jī)制不盡相同，因此對(duì)用于基因治療的裸DNA進(jìn)行改進(jìn)使其適合在靶器官表達(dá)是十分必要的。
　　 背景和目的:目前用于血友病基因治療的載體主要分為兩大類(lèi):病毒載體和非病毒載體。這兩類(lèi)載體各有優(yōu)缺點(diǎn)。病毒載體基因傳遞的效率高，但容易產(chǎn)生免疫反應(yīng)和插入突變;非病毒載體制備簡(jiǎn)單，安全性好，但是基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率低。因此我們?cè)噲D構(gòu)建一種即可高效感染靶細(xì)胞又能實(shí)現(xiàn)安全定點(diǎn)整合入宿主基因組的腺病毒嵌合載體。方法:通過(guò)一系列DNA操作構(gòu)建腺病毒·

7、整合酶嵌合系統(tǒng)。該系統(tǒng)包含兩個(gè)腺病毒載體:一個(gè)攜帶轉(zhuǎn)基因表達(dá)框，表達(dá)框內(nèi)有hFIX，紅色熒光蛋白編碼序列以及attB(phiC31識(shí)別位點(diǎn))，表達(dá)框兩側(cè)各有一個(gè)loxp( Cre識(shí)別位點(diǎn)).另一個(gè)腺病毒載體攜帶Cre和phiC31基因。同時(shí)構(gòu)建只表達(dá)Cre和只表達(dá)phiC31的載體作為對(duì)照載體。在體外分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，用熒光顯微鏡觀察熒光蛋白的表達(dá)，用RT PCR鑒定各個(gè)基因的表達(dá)。結(jié)果:經(jīng)PCR,酶切及測(cè)序方法鑒定，該腺病