1、1．研究目的： 紅斑狼瘡（Iupus erythematosus，LE）是一種多見于15～40歲女性、臨床上有多種表現(xiàn)、可累及全身任何臟器的自身免疫性結締組織病。紅斑狼瘡是一個病譜性疾病，病譜的一端為盤狀紅斑狼瘡（discoid lupus erythematosus，DLE），病變主要限于皮膚，另一端為有內(nèi)臟多系統(tǒng)受累、并常有皮膚損害的系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）。SLE臨

2、床表現(xiàn)多種多樣，血液系統(tǒng)主要表現(xiàn)為貧血、白細胞減少、血小板減少及血沉增快，其免疫學特征主要是高滴度的自身抗體和伴隨T淋巴細胞減少的自身反應性淋巴細胞增多。 間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是骨髓微環(huán)境中具有多種分化傾向、高度增殖及自我更新能力的非造血性干細胞，參與造血微環(huán)境形成，調(diào)控造血功能。MSCs是造血微環(huán)境中的重要成分，不僅起支持作用，而且分泌細胞因子，調(diào)節(jié)造血細胞增殖分化。

3、目前SLE的發(fā)病機理尚未完全闡明，以往研究多數(shù)著重于T、B淋巴細胞亞群比例失調(diào)或功能異常、細胞因子及其受體的改變等方面。近年用異體骨髓移植治療SLE患者，用正常的造血干細胞代替患者的病態(tài)干細胞，重建SLE患者的免疫細胞及血細胞，有可能根治SLE。此外有文獻報道雌性狼瘡鼠骨髓CFU—GM明顯減少，SLE患者T淋巴細胞形成能力下降，均提示SLE可能是干細胞疾病。最近有研究發(fā)現(xiàn)SLE患者的MSCs存在異常，發(fā)現(xiàn)SLE的發(fā)生、發(fā)展與造血微環(huán)境有

4、很大的關系。本研究希望通過探討MSCs與SLE患者血液系統(tǒng)損害的關系，為該病的發(fā)病機理提供新的依據(jù)。 2．研究方法： 本試驗共分為三組：①SLE活動期患者血清/MSCs組（11人）；②SLE非活動期患者血清/MSCs組（13人）；③正常人（對照組）血清/MSCs組（11人）。所有SLE患者均符合美國風濕病學會1982年制定的分類診斷標準，入院前均未使用激素和免疫抑制劑治療。SLE活動指數(shù)（SLEDAI評分）≥10分的患者

5、進入活動期組，SLEDAI評分<10分的患者進入非活動期組。對照組為我院門診健康體檢者。 抽取SLE患者及正常人的外周血后分離提取血清，制成含10％人血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基。觀察SLE患者血清對MSCs的生長、增殖及相關細胞因子的分泌的影響，方法步驟如下： 2．1 MSCs分離、純化、傳代及鑒定 2．2取P5代MSCs，用含10％人血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基重新懸浮細胞，進行培養(yǎng)。通過培養(yǎng)觀察間充

6、質干細胞的細胞生物學變化： 2．2．1繪制細胞生長曲線 2．2．2 MTT法檢測細胞增殖 2．23流式細胞儀檢測細胞凋亡 2．3取P5代MSCs，用含10％人血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基重新懸浮細胞，進行培養(yǎng)。觀察MSCs分泌的細胞因子IL—6、IL—7、SCF的變化： 2．3．1利用RT—PCR技術檢測MSCs分泌的細胞因子IL—6、IL—7、SCF在mRNA水平的變化。 2．3．2

7、利用Western blot技術檢測MSCs分泌的細胞因子IL—6、IL—7、SCF在蛋白水平的變化。 3．研究結果： 3．1 MSCs可以黏附到塑料瓶底部生長，形態(tài)呈長梭形。MSCs表型為CD29和CD44陽性，而CD45、CD106、CD71、CD34為陰性；體外培養(yǎng)的MSCs表面CD166的表達則不穩(wěn)定，部分標本呈陽性，部分則呈陰性。 3．2 MSCs的細胞生物學變化的比較 3．2．1分別對三組培養(yǎng)

8、MSCs繪制生長曲線，發(fā)現(xiàn)三組細胞的增長曲線基本相同，未見明顯的差別； 3．2．2通過MTT法分別檢測三組培養(yǎng)MSCs的細胞增殖，發(fā)現(xiàn)三組細胞的增殖基本相同，未見明顯的差別； 3．2．3通過流式細胞儀分別檢測三組培養(yǎng)MSCs的細胞凋亡。與正常對照組相比，SLE活動期組和非活動期組凋亡細胞數(shù)增多，具有統(tǒng)計學意義（P<0．05）。兩組之間比較，SLE活動期組凋亡細胞數(shù)目較非活動期組增多（P<0．05）。 3．3 RT

9、—PCR結果 3．3．1 IL—6：與正常對照組相比，SLE活動期組和非活動期組IL—6 mRNA在MSCs中表達顯著降低，具有統(tǒng)計學意義（P<0．05）。SLE活動期組和非活動期組之間比較無統(tǒng)計學差異（P>0．05）。 3_3．2 IL—7： SLE活動期組IL—7 mRNA在MSCs中表達較正常對照組顯著降低，具有統(tǒng)計學意義（P<0．05）。SLE活動期組和非活動期組之間比較無統(tǒng)計學差異（P>0．05）。 3

10、．3．3 SCF：三組之間SCF mRNA在MSCs中表達存在顯著的差異，SLE活動期組<非活動期組<正常組，具有統(tǒng)計學意義（P<0．05），特別是SLE活動期組與正常對照組之間的差異非常顯著（P<0．01）。 3．4 Western blot結果 3．4．1 IL—6：三組MSCs均分泌IL—6，與正常對照組相比，SLE活動期組和非活動期組MSCs分泌IL—6顯著降低，具有統(tǒng)計學意義（P<0．05）。SLE活動期組和非

11、活動期組之間比較無統(tǒng)計學差異（P>0．05）。 3．4．2 IL—7：三組MSCs均分泌IL—7，與正常對照組相比，SLE活動期組及非活動期組MSCs分泌IL—7顯著降低，具有統(tǒng)計學意義（P>0．05）。SLE活動期組和非活動期組之間比較無統(tǒng)計學差異（P>0．05）。 3．403 SCF：三組MSCs均分泌SCF，SLE活動期組及非活動期組SCF的表達顯著降低，且三組之間分泌SCF存在顯著的差異，具有統(tǒng)計學意義（P<0．