1、目的：探討人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)體外分離及純化的方法；人精原干細(xì)胞(Spermatogonialstem cells，SSCs)在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞飼養(yǎng)層上的生物學(xué)特征及增殖的可能機(jī)制。 方法： ①人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定：流產(chǎn)4h胎兒取雙側(cè)股骨，去除貼附在骨表面的肌肉組織，剪斷兩端骨垢，用DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔細(xì)胞入離心管，吹打后離心

2、8min(速度1000r/s)，去上清，加入含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×105/mL接種，將細(xì)胞置于37℃恒溫、5％CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)4h后，換液去除未貼壁細(xì)胞，以后每3d換液。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底70％-80％時(shí)傳代，傳代前24h細(xì)胞換液；吸出廢液，PBS沖洗，加含有EDTA的胰酶消化2min，Hank's終止消化，吹打，離心，按1：2的比例傳代，將細(xì)胞置37℃孵箱培養(yǎng)，4h換液，進(jìn)一步純化BMSC，以后每3

3、d換液。倒置顯微鏡下觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)及生物學(xué)特征，應(yīng)用MTT法間接測(cè)定各代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性。檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44。 ②人支持細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定：無(wú)菌條件下剪開(kāi)睪丸囊取出睪丸置培養(yǎng)皿中，去白膜后移至試管內(nèi)盡可能剪碎，加入十倍體積的1mg/mL膠原酶Ⅳ，在37℃、5％CO2條件下作用20min，靜止后去上清，加0.25％胰酶消化4min，加含血清DMEM終止消化，吹打，靜止后取上清，離心8min(速度100

4、0r/s)，去上清液，加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至3×105個(gè)/mL接種在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將細(xì)胞置于37℃恒溫、5％CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)4h，換液去除未貼壁細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底70％-80％時(shí)傳代，傳代前24h細(xì)胞換液。吸除廢液，PBS沖洗，加含有EDTA的胰酶消化2min，加Hank's終止消化，吹打使細(xì)胞重懸，離心，按1：2的比例傳代，將細(xì)胞置37℃孵箱培養(yǎng)，以后每3d換液。鑒定：支持細(xì)胞的油紅0染色，用以鑒定支持

5、細(xì)胞。 ③飼養(yǎng)層的制備：當(dāng)培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底70％-80％時(shí)，用含10 ug/mL絲裂霉素C的DMEM培養(yǎng)基處理同代的兩組骨髓間充質(zhì)細(xì)胞各1.5h，PBS液清洗后隨機(jī)取一組作為飼養(yǎng)層備用，另一組作為對(duì)照組(CG)。當(dāng)培養(yǎng)的人支持細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底70％-80％時(shí)，用絲裂霉素C處理，方法同上，作為飼養(yǎng)層備用。 ④精原干細(xì)胞的純化及鑒定：取材方法同培養(yǎng)支持細(xì)胞。將睪丸細(xì)胞懸液置于37℃恒溫、5％CO2的孵箱內(nèi)

6、培養(yǎng)，4h后吸取培養(yǎng)液，8min(速度1000r/s)離心后，去上清加含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，吹打，取少許細(xì)胞滴片檢測(cè)Thy-1，剩余細(xì)胞調(diào)整濃度至3×105個(gè)/mL，接種到準(zhǔn)備好的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和支持細(xì)胞飼養(yǎng)層上，分別作為實(shí)驗(yàn)組1(E-1)和實(shí)驗(yàn)組2(E-2)。 ⑤ELISA法檢測(cè)對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1培養(yǎng)液中的白血病抑制因子(LIF)。隔日換液，并收集兩組上清液，凍存于-20℃低溫冰箱中儲(chǔ)存，直至SSCs進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期

7、后。將兩組上清液解凍作酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)LIF的含量，兩組進(jìn)行對(duì)比，并作統(tǒng)計(jì)分析。 ⑥對(duì)比以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為飼養(yǎng)層和支持細(xì)胞為飼養(yǎng)層體外培養(yǎng)的SSCs增殖情況。在培養(yǎng)瓶自建坐標(biāo)，在四個(gè)象限分別選相應(yīng)的四個(gè)固定視野，每日拍照并計(jì)數(shù)SSCs，直至兩組SSCs都達(dá)到指數(shù)增長(zhǎng)期后，對(duì)比兩組SSCs增殖情況，最后利用SSCs表面特異性標(biāo)志物Thy-1做免疫組織化學(xué)鑒定。 結(jié)果： ①培養(yǎng)4h，見(jiàn)骨髓間充質(zhì)

8、干細(xì)胞已開(kāi)始貼壁，培養(yǎng)7d時(shí)，見(jiàn)細(xì)胞鋪滿瓶壁面積的70％-80％，細(xì)胞排列緊密，此時(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鋪成單層；H-E染色見(jiàn)細(xì)胞多為長(zhǎng)梭型，有突起及分支，胞體大，核一個(gè)，較大，呈圓形，著色淺；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44免疫組織化學(xué)陽(yáng)性； ②對(duì)照組的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上清液中LIF的含量較對(duì)照組高。 ③精原干細(xì)胞在支持細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為飼養(yǎng)層上均能夠保持非分化增殖，且在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上增殖的速度較在支持細(xì)胞上增