1、研究目的： 1.通過(guò)對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取、分離、培養(yǎng)和鑒定的方法和條件的研究，觀察人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和掌握其生長(zhǎng)規(guī)律，找到一種最佳的培養(yǎng)環(huán)境，建立一套體外分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，為深入研究人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞特性和在組織工程方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)； 2.通過(guò)不同濃度的5-氮胞苷(5-aza)誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞的比較，確定一種合適的誘導(dǎo)濃度；通過(guò)對(duì)5-aza誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)

2、化為心肌樣細(xì)胞后進(jìn)行鑒定，以確定心肌樣細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、形態(tài)和功能； 3.通過(guò)觀察內(nèi)皮素-1在誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞中的作用，以確定其是否可以促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 方法和結(jié)果：本研究共分三部分第一部分：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外分離、培養(yǎng)及鑒定方法：標(biāo)本來(lái)源于人的骨髓。采用淋巴細(xì)胞分離液行密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，再利用貼壁篩選法純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)，并對(duì)其進(jìn)行細(xì)

3、胞生長(zhǎng)和形態(tài)學(xué)的觀察、表面抗原的鑒定。 結(jié)果：hMSCs原代培養(yǎng)接種24h貼壁完成，2-3天細(xì)胞呈梭形，第9天形成多個(gè)克隆，第14-16天細(xì)胞融合成單層，梭形突起變長(zhǎng)，排列有明顯方向性，細(xì)胞排列成漩渦狀。傳代細(xì)胞24h內(nèi)完全貼壁，伸展成梭形，開始迅速增殖，7天即鋪滿培養(yǎng)瓶底，傳代細(xì)胞保持原代細(xì)胞的形態(tài)特征。隨代數(shù)增加，細(xì)胞得到純化，梭形細(xì)胞達(dá)95％以上。連續(xù)傳代至P8，細(xì)胞由梭形變?yōu)槠教?、寬大，分裂相減少，細(xì)胞質(zhì)疏松，可見空泡。

4、傳至P10,部分細(xì)胞變成圓形，折光增強(qiáng)，脫壁死亡。隨著傳代次數(shù)的增加，克隆形成率逐漸下降，10代后無(wú)明顯克隆出現(xiàn)。hMSCs表達(dá)CD29，CD44，但不表達(dá)CD34，CD45。 第二部分5-氮胞苷誘導(dǎo)人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞方法：第二代的hMSCs中分別加入濃度為2.5、5、10、20、40、80μmol/L的5-aza，作用24h后除去，繼續(xù)培養(yǎng)4周，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和形態(tài)學(xué)的變化，于誘導(dǎo)后第二周進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè)cT

5、nI，并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。利用RT-PCR技術(shù)，于誘導(dǎo)后1、2、3、4w，對(duì)hMSCs的ANP、BNP、α-skeletalactin、MLC-2v、GATA-4、Nkx2.5的基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用膜片鉗技術(shù)對(duì)誘導(dǎo)后2w的hMSCs進(jìn)行動(dòng)作電位檢測(cè)。 結(jié)果：5-氮胞苷處理24h后，各組均有部分細(xì)胞發(fā)生死亡，2.5、5和10μmol/L組僅有少量細(xì)胞死亡，而20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L組約30％細(xì)胞死亡

6、。誘導(dǎo)后7d，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)變化。細(xì)胞多緊密平行排列生長(zhǎng)，細(xì)胞體積變大，梭形細(xì)胞比例下降，多數(shù)細(xì)胞呈桿狀，少部分細(xì)胞呈不規(guī)則外形、長(zhǎng)梭形或橢圓形。40μmol/L、80μmol/L組細(xì)胞形態(tài)變化明顯。2-3w，細(xì)胞增殖減慢，部分細(xì)胞脫壁死亡，細(xì)胞數(shù)量較同期未經(jīng)誘導(dǎo)組明顯減少，其中40、80μmol/L5-aza組尤為明顯，死亡細(xì)胞數(shù)約占50％以上。相鄰細(xì)胞間胞膜有接觸，逐漸相連呈肌管狀，細(xì)胞核/漿比例明顯降低，胞漿內(nèi)有細(xì)小的顆粒樣結(jié)構(gòu)，且

7、顆粒樣結(jié)構(gòu)多聚集于細(xì)胞核周圍，大約30％左右細(xì)胞胞漿內(nèi)可見細(xì)絲樣結(jié)構(gòu)。4w時(shí)，40、80μmol/L組細(xì)胞的折光性減低、細(xì)胞活性減弱，繼續(xù)出現(xiàn)死亡的細(xì)胞。未觀察到轉(zhuǎn)化細(xì)胞的自主搏動(dòng)。誘導(dǎo)后4w，超微結(jié)構(gòu)觀察顯示典型肌小節(jié)結(jié)構(gòu)和心房顆粒。誘導(dǎo)后2w，5、10、20、40、80μmol/L組hMSCs可見cTnI表達(dá)陽(yáng)性。cTnI陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)率比較，10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L組之間無(wú)明顯差異，均

8、明顯高于5μmol/L組(P＜0.05)。RT-PCR檢測(cè)到ANP，BNP，α-skeletalactin，MLC-2v，Nkx2.5/Csx，GATA-4基因表達(dá)，且逐漸增加；10μmol/L組的各基因表達(dá)在不同時(shí)間點(diǎn)上與其它各組相比較在數(shù)值上均高于其它各組，在大部分點(diǎn)上差異顯著(P＜0.05)，部分無(wú)顯著差異(P＞0.05)。誘導(dǎo)后2w的hMSCs檢查到動(dòng)作電位。 第三部分內(nèi)皮素-1在誘導(dǎo)人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞中的

9、作用方法：第二代hMSCs分別加入5-aza(10μmol/L)，ET-1(30nmol/L)，5-aza(10μmol/L)+ET-1(30nmol/L)，分為對(duì)照組(Ⅰ組)、ET-1組(Ⅱ組)、5-aza組(Ⅲ組)和5-aza+ET-1聯(lián)合誘導(dǎo)組(Ⅳ組)，作用24h后除去，繼續(xù)培養(yǎng)4周，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和形態(tài)學(xué)的變化，于誘導(dǎo)后第二周進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè)cTnI，并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。利用RT-PCR技術(shù)，于誘導(dǎo)后1、2、3、4w,對(duì)h

10、MSCs的ANP、BNP、α-skeletalactin、MLC-2v、GATA-4、Nkx2.5的基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果：Ⅲ組和Ⅳ組的hMSCs轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞，Ⅳ組轉(zhuǎn)化的心肌樣細(xì)胞體積大，形態(tài)較成熟，Ⅰ組、Ⅱ組的hMSCs未向心肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。于誘導(dǎo)后第二周進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè)cTnI，Ⅲ組和Ⅳ組表達(dá)陽(yáng)性，Ⅳ組的染色較深，Ⅰ組、Ⅱ組為陰性。Ⅲ組和Ⅳ組RT-PCR檢測(cè)到ANP，BNP，α-skeletalactin，MLC-2

11、v，Nkx2.5/Csx，GATA4基因表達(dá)，基因表達(dá)量均隨著時(shí)間逐漸增加，Ⅰ組、Ⅱ組為陰性。Ⅳ組和Ⅲ組相比較，ANP表達(dá)在3、4w，差異顯著；BNP表達(dá)只在1w時(shí)，差異顯著；α-skeletalactin表達(dá)，3、4w差異顯著；MLC-2v，1、2、3、4w均差異顯著；GATA-4和Nkx2.5表達(dá)，無(wú)明顯差異。 結(jié)論： 1.利用淋巴細(xì)胞液進(jìn)行密度梯度離心法和貼壁篩選法，可分離、純化人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞的均一性高，

12、是一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、有效的分離提純?nèi)斯撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞的方法。 2.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可在體外分離、提純、擴(kuò)增，細(xì)胞數(shù)量足夠、遺傳背景穩(wěn)定可滿足組織工程的要求，是理想的種子細(xì)胞之一。 3.5-aza誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，10μmol/L是較佳的誘導(dǎo)濃度。 4.經(jīng)5-aza誘導(dǎo)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有肌管形成，具有心肌細(xì)胞的特異的免疫組化表現(xiàn)，表達(dá)心肌細(xì)胞的特定基因，為胎兒型心室細(xì)胞。5.內(nèi)皮素-1可促