1、目的:研究燈盞乙素及其芐酯衍生物對體外培養(yǎng)心肌細胞缺氧損傷的保護作用,并探討其可能機制。
　　 方法:
　　 1、采用新生1～3d的SD大鼠體外原代培養(yǎng)心肌細胞。
　　 2、采用MTT法檢測不同缺氧時間心肌細胞的生長狀態(tài),從而確定最佳缺氧時間,建立體外缺氧損傷模型。
　　 3、將搏動狀態(tài)良好,生長密度無明顯差異的心肌細胞隨機分為正常對照組、缺氧損傷模型組、燈盞乙素組(高、中、低劑量組:100gμmol/L

2、、50μmol/L、25μmol/L)和燈盞乙素芐酯衍生物組(高、中、低劑量組:100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L)(缺氧前分別加入干預(yù)藥物)。
　　 4、缺氧處理后,采用生化手段檢測各實驗組培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)、一氧化氮(NO)活性,研究燈盞乙素及其芐酯衍生物對心肌細胞膜缺氧損傷的保護作用。
　　 5、檢測各實驗組細胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性及脂質(zhì)氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量,研究

3、燈盞乙素及其芐酯衍生物對心肌細胞脂質(zhì)過氧化損傷的保護作用。
　　 6、采用H.E及Hochest-PI染色觀察燈盞乙素及其芐酯衍生物對缺氧心肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。
　　 7、采用流式細胞術(shù),研究燈盞乙素及其芐酯衍生物對缺氧誘導(dǎo)心肌細胞凋亡率的影響。
　　 8、采用RT-PCR技術(shù)檢測各實驗組Bcl-2、Bax、Cytochrome c、Caspase-3基因在mRNA水平的表達差異。
　　 9、通過Wes

4、tern Blot法檢測各實驗組Bcl-2、Bax、Cytochrome c、Caspase-3基因在蛋白水平的表達差異。
　　 結(jié)果:
　　 1、缺氧時間點的確定:心肌細胞缺氧損傷0-6h,細胞活性變化幅度最大,單位時間內(nèi)細胞缺氧損傷程度最大,確定6h為最佳缺氧時間點。
　　 2、生化指標測定:與正常對照組比較,模型組心肌細胞LDH的外漏量增加(P＜0.01),NO釋放量減少(P＜0.01),細胞內(nèi)SOD活性下

5、降(P＜0.01),MDA含量升高(P＜0.01);各劑量的燈盞乙素及其芐酯衍生物可顯著降低缺氧損傷心肌細胞LDH的外漏量(P＜0.01);高、中劑量的燈盞乙素及其芐酯衍生物可明顯增加缺氧損傷心肌細胞NO釋放量(P＜0.01);各劑量的燈盞乙素及高、中劑量的芐酯衍生物可提高缺氧損傷細胞內(nèi)SOD活性(P＜0.01),高劑量的燈盞乙素及其芐酯衍生物可減少缺氧損傷心肌細胞MDA的產(chǎn)生(P＜0.05)。
　　 3、H.E染色及Hoche

6、st-PI染色:高劑量的燈盞乙素及其芐酯衍生物可有效減輕缺氧損傷心肌細胞染色質(zhì)凝集、細胞核固縮等凋亡形態(tài)學(xué)變化。
　　 4、流式細胞術(shù)檢測:與正常對照組比較,模型組心肌細胞凋亡率顯著升高(P＜0.01),各劑量的燈盞乙素及高、中劑量的芐酯衍生物可明顯降低缺氧損傷細胞凋亡的百分率(P＜0.01)。
　　 5、RT-PCR結(jié)果:模型組bcl-2 mRNA的表達量較正常組顯著降低(P＜0.01),各劑量的燈盞乙素及高、中劑量的

7、芐酯衍生物可顯著上凋缺氧損傷心肌細胞內(nèi)bcl-2 mRNA的表達(P＜0.01);模型組bax mRNA的表達量較正常組顯著升高(P＜0.01),各劑量的燈盞乙素及高、中劑量的芐酯衍生物可顯著降低細胞中bax mRNA的表達(P＜0.01);模型組Cvtochrome c mRNA表達水平較正常組顯著升高(P＜0.01),各劑量的燈盞乙素及其芐酯衍生物可顯著降低細胞Cytochrome c mRNA的表達(P＜0.01);模型組Casp

8、ase-3 mRNA表達水平較正常組顯著升高(P＜0.01);各劑量的燈盞乙素及高、中劑量的芐酯衍生物可顯著降低細胞Caspase-3 mRNA的表達(P＜0.01)。
　　 6、Western Blot結(jié)果:模型組Bcl-2蛋白的表達量較正常組顯著降低(P＜0.01),各劑量的燈盞乙素及高、中劑量的芐酯衍生物可顯著上凋缺氧損傷心肌細胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達(P＜0.01);模型組Bax蛋白的表達量較正常組顯著升高(P＜0.01

9、),各劑量的燈盞乙素及高、中劑量的芐酯衍生物可顯著降低細胞中Bax蛋白的表達(P＜0.01):模型組Cytochromec蛋白表達水平較正常組顯著升高(P＜0.01),各劑量的燈盞乙素及其芐酯衍生物可顯著降低細胞Cytochrome c蛋白的表達(P＜0.01);模型組Caspase-3蛋白表達水平較正常組顯著升高(P＜0.01),各劑量的燈盞乙素及高、中劑量的芐酯衍生物可顯著降低細胞Caspase-3蛋白的表達(P＜0.01)。