1、背景和目的
　　 乳腺癌是嚴重危害婦女健康的一種疾病。Bmi-1基因(B-cell specificmoloney leukemia virus insert site l,Bmi-1)是PcG(polycomb group genes)家族重要的調(diào)節(jié)基因,位于人類10號染色體短臂1區(qū)3帶(10p13),在調(diào)節(jié)細胞周期及增殖方面具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),Bmi-1基因在乳腺癌及乳腺癌細胞系中高表達,與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但其

2、作用機制仍不清楚。
　　 研究顯示,在人正常鼻咽上皮細胞中過表達Bmi-1基因后,能夠激活hTERT的轉(zhuǎn)錄,誘導端粒酶活性并維持端粒在一定的長度,并且能夠下調(diào)p16INK4a的表達,影響細胞周期及增殖,促使人正常鼻咽上皮永生化。此外,Bmi-1基因可以維持胚胎干細胞和腫瘤干細胞的自我更新及增殖活性,目前已有研究證明,在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細胞中,過表達Bmi-1基因后,能夠上調(diào)Oct-4的表達,提示Bmi-1基因可能在干細胞水平參

3、與了神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展。
　　 在以往研究的基礎上,本研究構(gòu)建人Bmi-1基因的真核表達載體pcDNA3.1(+)-Bmi-1。轉(zhuǎn)染人乳腺癌MDA-MB-468細胞48h后,RT-PCR鑒定目的基因Bmi-1的mRNA表達變化,以G418進行篩選,建立了pcDNA3.1(+)-Bmi-1真核表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的乳腺癌細胞系。應用免疫細胞化學方法驗證Bmi-1基因蛋白水平上的表達變化。應用RT-PCR的方法檢測Bmi-1基因mR

4、NA水平上的表達變化。通過MTT技術(shù)檢測pcDNA3.1(+)-Bmi-1表達載體對MDA-MB-468細胞的影響,為進一步深入探討B(tài)mi-1基因在乳腺癌中發(fā)生作用的分子機制提供實驗基礎。
　　 材料與方法
　　 1.主要材料:人乳腺癌MDA-MB-468細胞由鄭州大學中英醫(yī)學實驗室饋贈；真核表達載體pcDNA3.1(+)由鄭州大學生化教研室臧明璽教授及鄭州大學組胚教研室楊繼要老師惠贈。
　　 2.構(gòu)建pcDNA

5、3.1(+)-Bmi-1真核表達載體:采用半定量RT-PCR的方法檢測乳腺癌MDA-MB-468細胞及MCF-7細胞中Bmi-1mRNA的表達。從MCF-7細胞中提取細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR擴增Bmi-1 cDNA全長。將Bmi-1基因片段經(jīng)T-A克隆后亞克隆至真核表達載體pcDNA3.1(+),構(gòu)建成人Bmi-1基因的真核表達載體pcDNA3.1(+)-Bmi-1,酶切、電泳及測序鑒定。
　　 3.細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

6、:乳腺癌MCF-7細胞培養(yǎng)于含有10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中,37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)；乳腺癌MDA-MB-468細胞于含有10％FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中,37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染MDA-MB-468細胞前,更換新鮮培養(yǎng)基。采用高純度中量質(zhì)粒提取試劑盒抽提pcDNA3.1(+)與pcDNA3.1(+)-Bmi-1。MDA-MB-468細胞隨機分為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組,空載體組和空白對照組,用Lipofe

7、cter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將pcDNA3.1(+)-Bmi-1導入重組載體轉(zhuǎn)染組,將。pcDNA3.1(+)導入空載體組,空白對照組未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。
　　 4.篩選與擴增:轉(zhuǎn)染后的細胞鋪滿培養(yǎng)板后,按1:4的密度比傳代至新的培養(yǎng)板。于含有1mg/mlG418的DMEM高糖選擇性培養(yǎng)基中篩選,每3d更換一次培養(yǎng)基,至第7天,空白對照組細胞死亡,改用400μg/ml的選擇性培養(yǎng)基繼續(xù)篩選,約2w后,陽性細胞克隆形成,將單克隆細胞挑入24孔板

8、,繼續(xù)培養(yǎng)。細胞鋪滿培養(yǎng)板后,移入培養(yǎng)瓶擴大培養(yǎng)。
　　 5.pcDNA3.1(+)-Bmi-1表達載體對乳腺癌MDA-MB-468細胞的效應:應用免疫細胞化學檢測Bmi-1、hTERT、p16INK4a及Oct-4蛋白表達水平的變化；應用RT-PCR檢測Bmi-1及hTERT的mRNA表達水平變化;應用MTT法檢測細胞增殖情況的改變。
　　 6.統(tǒng)計學處理:應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理,數(shù)值用(X)

9、±S表示。采用單因素方差分析進行組見差異比較,以a=0.05為檢驗水準。
　　 結(jié)果：
　　 1.真核表達載體pcDNA3.1(+)-Bmi-1的構(gòu)建:Bmi-1 mRNA在MCF-7細胞中表達較高,而在MDA-MB-468細胞中僅適量表達；從MCF-7細胞中提取細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR擴增Bmi-1 cDNA全長,并通過膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行回收純化；T-A克隆后,行菌液PCR、酶切圖譜驗證重組陽性

10、克隆；對pcDNA3.1(+)-Bmi-1進行酶切和序列分析,酶切圖譜及插入序列與預期結(jié)果一致。
　　 2.瞬時轉(zhuǎn)染MDA-MB-468細胞:3組細胞中Bmi-1及hTERT的mRNA相對表達量分別為:重組載體轉(zhuǎn)染組,0.943±0.095和0.396±0.015?？蛰d體組,0.603±0.015和0.244±0.007?？瞻讓φ战M,0.600±0.014和0.240±0.006。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Bmi-1及hTERT的mRNA表

11、達水平高于空載體組和空白對照組(P<0.05)。
　　 3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后Bmi-1及hTERT的表達:3組細胞中Bmi-1和hTERT的蛋白相對表達量分別為:重組載體轉(zhuǎn)染組,8.77±1.12和6.59±0.40?？蛰d體組,6.05±0.43和4.66±0.39?？瞻讓φ战M,6.07±0.35和4.17±0.58。3組細胞中Bmi-1和hTERT的mRNA相對表達量分別為:重組載體轉(zhuǎn)染組,1.001±0.040和0.402±0.0

12、18?？蛰d體組,0.628±0.034和0.263±0.022?？瞻讓φ战M,0.600±0.033和0.266±0.321。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Bmi-1、hTERT的表達水平高于空載體轉(zhuǎn)染組和空白對照組(P<0.05)。
　　 4.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后p16INK4a及Oct-4的蛋白表達:3組細胞中p16INK4a和Oct-4的蛋白相對表達量分別為:重組載體轉(zhuǎn)染組,2.90±0.33和4.09±0.14?？蛰d體組,5.28±0.34和2.1

13、4±0.19。空白對照組,4.96±0.37和2.18±0.15。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組p16INK4a蛋白表達水平低于空載體組和空白對照組(P<0.05),而重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Oct-4的蛋白表達水平高于空載體組和空白對照組(P<0.05)。
　　 5.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后MTT結(jié)果:3組細胞吸光值分別為:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組,0.718±0.015?？蛰d體組,0.481±0.009?？瞻讓φ战M,0.506±0.010。與其它兩組相比,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞

14、增殖能力顯著增強(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.構(gòu)建了人Bmi-1基因的真核表達載體pcDNA3.1(+)-Bmi-1.
　　 2.建立了穩(wěn)定高表達Bmi-1的乳腺癌細胞系。
　　 3.真核表達載體pcDNA3.1(+)-Bmi-1轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-468細胞后,Bmi-1表達活性增高,并且其過表達可上調(diào)hTERT及Oct-4的表達,下調(diào)p16INK4a的表達,并有效增強乳腺癌MDA-M