1、辣椒疫病是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的、世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的、毀滅性土傳病害，20世紀90年代曾在中國20多個省連續(xù)爆發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟損失。由于疫霉菌特殊的生物學性狀及其所在的土壤生態(tài)環(huán)境的復雜性，該病害的化學防治一直較為困難。盡管有許多用生防微生物控制該病害發(fā)生的報道，但防效均不理想。 本研究從挖掘生防微生物資源、獲得天然抗菌化合物角度出發(fā)，開展了從各種生境中進行辣椒疫霉拮抗菌的篩選、盆栽

2、防效試驗、拮抗物質(zhì)生成的最適培養(yǎng)條件確定、拮抗物質(zhì)的分離純化、鑒定及分子標記研究，取得如下結(jié)果。 以辣椒疫霉為靶標病原菌，從連作辣椒不同年限的土壤、用不同原料及制作工藝制得的堆肥、各種蔬菜作物體內(nèi)等各種生態(tài)環(huán)境中篩選到辣椒疫霉的拮抗菌205株，其中拮抗真菌32株，拮抗放線菌78株，拮抗細菌95株，其中內(nèi)生芽孢細菌37株，將在室內(nèi)平板上拮抗作用強、持續(xù)時間長的放線菌A576、A329、芽孢細菌B105、BS211、真菌Tpc、Ps

3、t10進行液體培養(yǎng)，通過各菌株無菌培養(yǎng)濾液(sterile liquid culturefilter，SLCF)對辣椒疫霉的抑菌活性及各菌株菌體及液體培養(yǎng)物對辣椒疫病的盆栽防效比較，顯示真菌Pst10有較好的辣椒疫病生防潛力。經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學院微生物菌種保藏中心鑒定，Pst10為青霉稀有種Penicillium striatisporum.首次報道在中國境內(nèi)分離到該種青霉，并將其應(yīng)用于植物病害的生物防治。 抗菌譜測定表明青霉Pst

4、10對p.capsici、p.infestans、p.drechsleri、p.nicotianae、p.megasperma五種疫霉菌的菌絲生長均有強烈的抑制作用，拮抗帶寬度30mm，并且對Cladosporium cucumerium和Sclerotinia sclerotiorum也有較強的拮抗作用，且在室內(nèi)平板上，拮抗帶30天不消失。Pst10液體培養(yǎng)制備的SLCF能殺死辣椒疫霉菌絲細胞，抑制孢子囊的形成，抑制孢子囊及孢子的萌發(fā)

5、，SLCF稀釋10-100倍仍能使辣椒疫霉菌絲呈現(xiàn)直徑明顯增粗、菌絲前端扭曲、菌絲分枝增加、分枝菌絲節(jié)間縮短等畸形癥狀。在辣椒基質(zhì)盆栽實驗中，單獨施用Pst10的SLCF，在6天內(nèi)能完全抑制疫病的發(fā)生，13天后，防效仍保持45％。在菜園土盆栽實驗中，有機肥能明顯促進Pst10在辣椒根際的定殖：盆缽栽苗10d后，青霉Pst10+有機肥處理中，辣椒根際青霉Pst10的數(shù)量是單獨施加青霉Pst10處理的3倍；20d后上升為17倍。接種后40d

6、，青霉Pst10在根際的數(shù)量仍有2.55×104cfu/g干土，占根際真菌總數(shù)的53％，有很強的定殖及保持優(yōu)勢種群的能力.青霉Pst10不同處理的防病實驗結(jié)果顯示：SLCF+Pst10+有機肥的處理對辣椒疫病的防效最好，移栽后14天，疫病發(fā)病率也僅有10％，對照發(fā)病率為100％。 Pst10在5種固體培養(yǎng)基上的菌絲生長速度、分泌物及孢子產(chǎn)生數(shù)量等生物學形狀有很大差別，OAT是最適宜的產(chǎn)孢培養(yǎng)基。Pst10在9種液體培養(yǎng)基中的生

7、物量、菌絲球形狀及SLCF的抗菌活性也有顯著性差異。綜合考慮菌絲生物量和SLCF的抗菌活性，PEDB是Pst10最適宜的液體培養(yǎng)基。在9種培養(yǎng)基中都能生長，在Vogel及Jackson培養(yǎng)基中生長良好但卻沒有抗菌物質(zhì)生成，可見菌絲生長和抗菌物質(zhì)生成之間沒有必然相關(guān)性?？咕镔|(zhì)生成的培養(yǎng)條件研究表明，接種量對抗菌物質(zhì)生成沒有影響，Pst10在20-37℃溫度范圍內(nèi)都能代謝產(chǎn)生拮抗物質(zhì)，但28℃是最適合的溫度。裝液量對抗菌物質(zhì)的生成有影響，

8、250 mL三角瓶中裝20-100 mL液體培養(yǎng)基對青霉Pst10代謝產(chǎn)生抗菌物質(zhì)沒有明顯差異，裝液超過100mL，抗菌物質(zhì)的生成減少，說明Pst10產(chǎn)生抗菌物質(zhì)需要氧氣。在最適培養(yǎng)條件下，Pst10從第4天開始大量產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，第8天達到高峰，高峰期維持7-8天. 對SLCF的抗菌活性檢測方法開展了研究。在SLCF制備中發(fā)現(xiàn)，當接種量為1-4個菌餅時，用細菌濾膜過濾制備SLCF的抗菌活性顯著低于用高速離心法獲得SLCF的活性，

9、部分抗菌物質(zhì)被吸附在濾膜上，但這種差異隨著接種量的增加而減小。推測可能接種量對Pst10的SLCF的總體活性沒有明顯影響，但對Pst10產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的種類有影響：接種量小時，Pst10產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)中，易被細菌濾膜吸附的抗菌物質(zhì)占較大比例；接種量大時，Pst10產(chǎn)生較多不被濾膜吸附的抗菌物質(zhì)。由此可見Pst10代謝產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)是復雜多樣的。采用平板打孔-抑菌圈法、含毒平板-菌絲生長抑制法及SLCF直接滴加三種方法對SLCF的抗菌活性

10、進行檢測，研究發(fā)現(xiàn)SLCF直接滴加法最靈敏；研究還發(fā)現(xiàn)，活性檢測所用的培養(yǎng)基種類對檢測結(jié)果有明顯影響，SLCF在PDA上的抗菌活性大于在V8培養(yǎng)基上的活性。 與平板法檢測抗菌物質(zhì)相比，薄層層析法(TLC)檢測能獲取更多信息，因為在檢測的同時就對抗菌物質(zhì)進行了初步的分離。通過觀察薄層層析板上抑菌圈的數(shù)量及位置就可初步判斷抗菌物質(zhì)的大概有幾大類及各類抗菌物質(zhì)的相對極性強弱。 將Pst10的PEDB培養(yǎng)液經(jīng)紗布過濾，把濾液離心

11、、真空濃縮100倍后用乙酸乙酯萃取獲得抗菌物質(zhì)粗提物；該粗提物經(jīng)TLC分離后，在254nm紫外光線下觀察到6條帶，分別將6條帶中的化合物回收后用辣椒疫霉進行生物測定，結(jié)果顯示只有條帶5有抗菌活性；將從條帶5中回收的抗菌物質(zhì)經(jīng)硅膠柱層析，洗脫液中第5-8管有抗菌活性，將4管洗脫液合并濃縮后經(jīng)HPLC分離，初步共收集到4組有活性的組分，改變洗脫條件，凸顯有活性的洗脫峰，用HPLC制備型分離柱收集獲得2個含量最大的活性組分fraction1和

12、fraction5；將組分1和組分5進行1HNMR和13CNMR及二維NMR分析、紫外吸收光譜掃描，最后鑒定為Calbistrin A和Calbistrin B，二者互為同分異構(gòu)體，分子式C31H40O8，分子量540.26。在中間每個分離步驟所得的活性物質(zhì)中都能檢測到Calbistrin A和Calbistrin B存在，說明二者均是由Pst10代謝產(chǎn)生。 對常見微生物的生物活性測定顯示：Calbistrin A和Calbis

13、trin B對假單胞菌細菌沒有活性，但對芽孢細菌有抗生活性，且Calbistrin B的活性顯著高于Calbistrin A。Calbistrin A和Calbistrin B對辣椒疫霉孢子萌發(fā)的MIC分別為7.5μg/mL和1.25μg/mL，Calbistrin B的活性是Calbistrin A的6倍。種子發(fā)芽實驗顯示，Calbistrin B的濃度對蘿卜種子的發(fā)芽率及根長沒有顯著影響。 采用根癌農(nóng)桿菌介導的方法獲得Pst