1、目的： 本研究對(duì)一系列吡唑啉酮衍生物(Lgf-YL)在四種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞HepG2、OVCAR3、KB及KBv200進(jìn)行體外篩選，發(fā)現(xiàn)一種吡唑啉酮水楊酰肼席夫堿類(lèi)化合物(Lgf-YL-9)的細(xì)胞毒活性最為顯著，從而進(jìn)一步就Lgf-YL-9對(duì)人口底癌KB細(xì)胞及其MDR KBv200細(xì)胞的體內(nèi)外抗增殖活性及分子機(jī)制進(jìn)行研究。 方法： 采用MTT法對(duì)13種吡唑啉酮衍生物進(jìn)行細(xì)胞毒測(cè)定及體外篩選；裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)研究Lgf-

2、YL-9對(duì)KB及KBv200細(xì)胞裸鼠移植瘤的抗增殖作用；光鏡及熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)；DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA ladder及藥物與DNA反應(yīng)測(cè)定；Annexin V-PI雙染法分析細(xì)胞凋亡率；流式細(xì)胞儀檢測(cè)△ψ m及細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的變化；Western Blot研究細(xì)胞凋亡途徑及分子機(jī)制。 結(jié)果： 1、吡唑啉酮衍生物的抗增殖作用。吡唑啉酮衍生物

3、對(duì)HepG2、OVCAR3、KB及KBv200細(xì)胞的體外篩選Lgf-YL-2、-5、-13對(duì)四種腫瘤細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒活性(IC<,50>>100μg/ml)。Lgf-YL-7、-12對(duì)HepG2和KBv200細(xì)胞有微弱的細(xì)胞毒活性。Lgf-YL-1、-3對(duì)HepG2細(xì)胞以及Lgf-YL-6、-8對(duì)KB細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒活性(IC<,50>>100μg/mL)，對(duì)其他三種細(xì)胞的細(xì)胞毒活性較弱。Lgf-YL-4、-11對(duì)四種細(xì)胞展現(xiàn)了中等程度的細(xì)胞毒

4、活性。值得注意的是Lgf-YL-9、-10對(duì)四種腫瘤細(xì)胞顯示了顯著的細(xì)胞毒活性，尤其是Lgf-YL-9的細(xì)胞毒活性最強(qiáng)，而且Lgf-YL-9對(duì)KBv200細(xì)胞的細(xì)胞毒活性是Lgf-YL-10的八倍，以上結(jié)果表明Lgf-YL-9作為一種新型的抗癌物質(zhì)值得被進(jìn)一步研究。 Lgf-YL-9在體內(nèi)外對(duì)KB和KBv200細(xì)胞的抗增殖作用體外MTT測(cè)定結(jié)果Lgf-YL-9對(duì)KB和KBv200細(xì)胞的IC<,50>值分別為3.81±0.02μg

5、/ml和3.45±0.03μg/ml，兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異無(wú)顯著性。體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示給藥濃度為1.5、3、6 mg/kg的Lgf-YL-9對(duì)KB及KBv200細(xì)胞移植瘤的抑瘤率分別為22.98﹪、34.68﹪、43.15﹪及25.37﹪、38.43﹪、47.50﹪。 2、Lgf-YL-9誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用本研究采用多種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)Lgf-YL-9誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。光鏡下觀察到Lgf-YL-9對(duì)四種腫瘤細(xì)胞的損傷呈濃度依賴(lài)性增

6、大。12μg/mL的Lgf-YL-9作用于KB及KBv200細(xì)胞24小時(shí)后，Hoechst 33258染色在熒光顯微鏡下可見(jiàn)對(duì)照組細(xì)胞呈均勻彌散藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞呈濃染致密的顆粒狀熒光，并有典型的凋亡小體形成。采用DNA瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)證實(shí)Lgf-YL-9能誘導(dǎo)KB和KBv200細(xì)胞的DNA出現(xiàn)凋亡相關(guān)的DNA ladder改變并呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴(lài)性遞增。Annexin V-PI雙染測(cè)定Lgf-YL-9對(duì)KB及KBv200細(xì)胞的凋亡率

7、，結(jié)果顯示Lgf-YL-9對(duì)這兩種腫瘤細(xì)胞的凋亡作用相近。 3、Lgf-YL-9誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制探討。 Lgf-YL-9誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能不是通過(guò)與DNA發(fā)生嵌合作用為探討Lgf-YL-9誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否與LgfoyL-9和DNA發(fā)生嵌合反應(yīng)有關(guān)，采用藥物與DNA反應(yīng)測(cè)定實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)在Lgf-YL-9與DNA的反應(yīng)體系中，不同濃度的Lgf-YL-9分別作用于KB和KBv200細(xì)胞不同時(shí)間后，DNA熒光強(qiáng)度與對(duì)照相比

8、無(wú)改變。在表阿霉素(Epirubicin，EDR)作用下，DNA熒光強(qiáng)度與對(duì)照相比呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性降低。結(jié)果提示EDR能夠與KB和KBv200細(xì)胞的DNA發(fā)生嵌合反應(yīng)，而Lgf-YL-9可能不與KB和KBv200細(xì)胞的DNA發(fā)生嵌合反應(yīng)。 Lgf-YL-9可能不是通過(guò)死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為探討Lgf-YL-9誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否與死亡受體途徑有關(guān)，采用WestemBlot方法檢測(cè)死亡受體途徑的啟動(dòng)Caspase即Caspas

9、e-8，結(jié)果在KB及KBv200細(xì)胞均未檢測(cè)到Caspase-8的激活裂解帶。 Lgf-YL-9是通過(guò)非依賴(lài)ROS升高的線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡Lgf-YL-9誘導(dǎo)的凋亡是否與線粒體凋亡途徑有關(guān)呢?采用DiOC<,6>(3)熒光染料對(duì)△ψm進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示不同濃度的Lgf-YL-9分別作用KB和KBv200細(xì)胞24小時(shí)后，兩種細(xì)胞的△ψm均呈濃度依賴(lài)性下降。Western Blot進(jìn)一步測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Cyto-C含量及Caspa

10、se-9、-3、-7及多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)，結(jié)果顯示不同濃度Lgf-YL-9作用KB和KBv200細(xì)胞24小時(shí)后，胞漿Cyto-C均呈濃度依賴(lài)性聚集并誘導(dǎo)了凋亡相關(guān)蛋白的激活。采用DCFH-DA熒光染料對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示12μg/ml的Lgf-YL-9作用KB和KBv200細(xì)胞24小時(shí)后，兩種細(xì)胞內(nèi)的ROS與對(duì)照組相比呈顯著性下降。 Lgf-YL-9

11、可以調(diào)節(jié)Bcl-2家族主要蛋白的表達(dá)Bcl-2家族成員與線粒體凋亡途徑關(guān)系密切，我們采用Westem Blot方法檢測(cè)Bcl-2家族中幾個(gè)重要的成員：Bcl-2、Bcl-xL、Bax及Bad。不同濃度的Lgf-YL-9分別作用于KB和KBv200細(xì)胞24小時(shí)后，結(jié)果顯示Lgf-YL-9可以下調(diào)Bcl-2及Bcl-XL的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)了Bad的表達(dá)，但對(duì)Bax的表達(dá)無(wú)影響。 3.3.5 Lgf-YL-9可能不作用于AKT及ERK-MAPK

12、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為探討Lgf-YL-9是否作用于細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)通路AKT及ERK-MAPK，不同濃度的Lgf-YL-9分別作用于KB和KBv200細(xì)胞24小時(shí)后，采用Western Blot方法檢測(cè)p-AKT、AKT及p-ERK1/2、ERK1/2的表達(dá)。結(jié)果證實(shí)在總的AKT及ERK1/2表達(dá)無(wú)變化的情況下，Lgf-YL-9沒(méi)有下調(diào)p-AKT及p-ERK1/2的表達(dá)。 4、Lgf-YL-9沒(méi)有下調(diào)KBv200細(xì)胞P-gp的表達(dá)為探討M

13、DR KBv200細(xì)胞對(duì)Lgf-YL-9不具有凋亡抗性的原因，采用WesternBlot方法檢測(cè)P-gp的表達(dá)，不同濃度的Lgf-YL-9分別作用于KB和KBv200細(xì)胞24小時(shí)后，結(jié)果顯示敏感株KB細(xì)胞中沒(méi)有P-gP的表達(dá)，Lgf-YL-9沒(méi)有改變MDR KBv200細(xì)胞中P-gP的表達(dá)。 結(jié)論： 1) 13種吡唑啉酮衍生物在四種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞體外篩選的結(jié)果證實(shí)Lgf-YL-9的細(xì)胞毒活性最為顯著。 2) 體內(nèi)外

14、抗增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)Lgf-YL-9對(duì)KB及MDR KBv200細(xì)胞具有相近的抗增殖活性。 3) Lgf-YL-9能夠誘導(dǎo)KB及MDR KBv200細(xì)胞凋亡。 4) Lgf-YL-9誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑可能不是通過(guò)死亡受體途徑，而是通過(guò)非依賴(lài)ROS升高的線粒體途徑。 5) Lgf-YL-9能夠調(diào)節(jié)Bcl-2家族主要蛋白的表達(dá)；初步認(rèn)為L(zhǎng)gf-YL-9不與DNA發(fā)生嵌合反應(yīng)，也不作用于AKT及ERK-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。