1、研究背景：
　　 1型糖尿病是自身免疫性疾病，以T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)、巨噬細(xì)胞浸潤，最終導(dǎo)致胰島β細(xì)胞自身免疫性破壞。同時(shí)，胰島β細(xì)胞凋亡對糖尿病的發(fā)生發(fā)展也起重要作用。T1D占糖尿病總患病率的10％，近年來發(fā)病率逐年上升，據(jù)報(bào)道全球患病率以每年3％的速度增長，預(yù)計(jì)2010年將比1998年的患病率增加40％。
　　 近年來運(yùn)用基因重組技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將目的基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞，使靶細(xì)胞組織局部高表達(dá)目的基因已成為現(xiàn)實(shí)。胰島β細(xì)胞局

2、部表達(dá)細(xì)胞因子IGF-1將有助于保護(hù)胰島β細(xì)胞功能和促進(jìn)胰島β細(xì)胞存活再生，IGF-1可能具有防治1型糖尿病的作用。
　　 目的：
　　 本研究首先利用腺病毒載體構(gòu)建攜帶大鼠胰島素樣生長因子1的重組腺病毒，檢測重組腺病毒滴度、目的基因是否有效合成和表達(dá)，Ad-rIGF-1是否能夠轉(zhuǎn)染鼠胰島β細(xì)胞。鏈脲佐菌素具有選擇性破壞胰島β細(xì)胞的作用，被廣泛用于建立糖尿病動(dòng)物模型，在體外研究中誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞損害。Ad-rIGF-1轉(zhuǎn)染

3、鼠胰島β細(xì)胞后，利用STZ誘導(dǎo)β細(xì)胞破壞，觀察鼠胰島β細(xì)胞的胰島素釋放功能、細(xì)胞存活率以及細(xì)胞凋亡，探討STZ誘導(dǎo)鼠胰島β細(xì)胞破壞的機(jī)制，以及rIGF-1對胰島β細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制；為下一步rIGF-1防治1型糖尿病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、IGF-1作為候選基因用于1型糖尿病的防治，提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、重組腺病毒載體的構(gòu)建和鑒定，重組腺病毒的包裝、擴(kuò)增及滴度測定
　　 取鼠肝臟組織，TRIZOL一步

4、法提取總RNA，cDNA第一鏈合成采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，以其為模板，PCR反應(yīng)擴(kuò)增rIGF-1 cDNA。RT-PCR純化產(chǎn)物和pAdTrack-CMV分別經(jīng)BglⅡ和EcoR V雙酶切，凝膠回收酶切產(chǎn)物，經(jīng)T4 DNA連接酶過夜連接。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌JM109，卡那霉素平板篩選陽性克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，正確克隆命名為pAdTrack-rIGF-1，送上海生工測序。將正確重組pAdTrack-rIGF-1穿梭質(zhì)粒經(jīng)PmeI酶切，完全線形

5、化后轉(zhuǎn)化包含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1的感受態(tài)大腸桿菌BJ5183，進(jìn)行同源重組?？敲顾剡x擇性培養(yǎng)基篩選陽性克隆，鑒定正確的重組腺病毒質(zhì)粒命名為pAd-rIGF-1。
　　 pAd-rIGF-1質(zhì)粒經(jīng)PacI酶切，在脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，第7天在出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變效應(yīng)后收集病毒，命名為Ad-rIGF-1。同樣條件包裝擴(kuò)增不含目的基因的空腺病毒

6、載體，作為病毒載體對照，命名Ad-eGFP。測定病毒滴度。
　　 2、轉(zhuǎn)染RINm-5F細(xì)胞目的基因表達(dá)的檢測
　　 RINm-5F細(xì)胞于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞80％匯合時(shí)，以約l×106pfu/ml的Ad-rIGF-1、Ad-eGFP直接轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48h，之后進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)檢測。
　　 3、轉(zhuǎn)染細(xì)胞目的基因和產(chǎn)物的檢測
　　 ①RT-PCR：

7、收集轉(zhuǎn)染后RINm-5F細(xì)胞，Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，以DNase酶消化去除DNA污染，RT-PCR擴(kuò)增目的基因片段。
　　 ②ELISA：收集上述細(xì)胞培養(yǎng)液上清，ELISA法檢測目的基因的表達(dá)。
　　 ③Western blotting：轉(zhuǎn)染48h后裂解細(xì)胞，以SDS-PAGE分離蛋白，一抗為羊抗鼠IGF-1特異多克隆IgG，辣根過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗羊IgG為二抗進(jìn)行Westernblotting分析。

8、
　　 4、胰島素釋放試驗(yàn)和NO測定
　　 6個(gè)實(shí)驗(yàn)組(對照組、STZ組、Ad-IGF-1組、Ad-IGF-1+STZ組、Ad-eGFP組、Ad-eGFP+STZ組)，分別加入含有終濃度為0和/或1.5mmol/L STZ的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h。收取培養(yǎng)上清液，Griess反應(yīng)測NO；以不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液清洗細(xì)胞2遍，加入含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24h；不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液清洗細(xì)

9、胞后，加入含終濃度16.7mmol/L葡萄糖、0.2％BSA的無血清1640培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)60min，取培養(yǎng)上清檢測胰島素。
　　 5、RINm-5F細(xì)胞凋亡的檢測
　　 如上所述的6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，待病毒轉(zhuǎn)染和STZ處理相應(yīng)組后，用含0.25％胰酶和0.2％EDTA的消化液消化并吹散細(xì)胞，計(jì)數(shù)5×105個(gè)細(xì)胞以PBS洗滌收集，70％冰預(yù)冷乙醇固定，PI避光染色，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。
　　 6、細(xì)胞存活率分

10、析
　　 RINm-5F接種96孔培養(yǎng)板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，細(xì)胞處理方式同前，之后棄去培養(yǎng)液，加入1mg/ml MTT于37℃孵育3h，棄去MTT加入二甲亞砜，振搖15min，取490nm測定光密度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率是以對照組細(xì)胞存活率為100％，實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞存活率=(各實(shí)驗(yàn)組OD均值/對照組OD均值)×100％。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功構(gòu)建重組腺病毒
　　 RT-PC

11、R合成rIGF-1 cDNA產(chǎn)物，RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析可見約406bp清晰的電泳條帶。構(gòu)建的pAdTrack-rIGF-1穿梭質(zhì)粒，以BglⅡ和EcoRV雙酶切經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，得到406bp和9200bp2個(gè)片段，與預(yù)期值相符；測序結(jié)果與GenBank報(bào)道一致。重組腺病毒載體pAd-rIGF-1經(jīng)PacⅠ酶切后，電泳可觀察到一條大的DNA片段和一條較小的DNA片段。經(jīng)PacⅠ酶切線形化的pAd-rIGF-1和pAd

12、-eGFP分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，16h后熒光顯微鏡見到GFP的表達(dá)?？焖傧俨《靖腥痉ǖ味葯z測，Ad-rIGF-1滴度：4.0×108pfu/ml；Ad-eGFP滴度：8.5×108pfu/ml。
　　 2、Ad-rIGF-1轉(zhuǎn)染RINm-5F細(xì)胞目的基因表達(dá)的檢測
　　 ①RT-PCR：Ad-rIGF-1轉(zhuǎn)染RINm-5F的細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA經(jīng)DNase酶消化后，擴(kuò)增得到406bp目的條帶，Ad-eGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對照組

13、RINm-5F細(xì)胞沒有目的條帶。
　　 ②ELISA：Ad-rIGF-1轉(zhuǎn)染RINm-5F細(xì)胞48h，收取培養(yǎng)上清，ELISA法測鼠rIGF-1蛋白，71.60±10.33 ng/ml，對照組RINm-5F細(xì)胞和Ad-eGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中未檢測到該蛋白表達(dá)。
　　 ③Western blotting：轉(zhuǎn)染Ad-rIGF-1的RINm-5F細(xì)胞有特異性rIGF-1條帶，對照組RINm-5F細(xì)胞和Ad-eGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞

14、無此特異性條帶。
　　 以上結(jié)果證明重組腺病毒Ad-rIGF-1能夠有效轉(zhuǎn)染RINm-5F細(xì)胞，目的基因能夠在轉(zhuǎn)染后RINm-5F細(xì)胞有效合成和釋放。
　　 3、rIGF-1對STZ作用大鼠胰島β細(xì)胞分泌胰島素的影響
　　 對照組、Ad-rIGF-1和Ad-eGFP轉(zhuǎn)染RINm-5F細(xì)胞胰島素釋放量差異無顯著性(P＞0.05)；STZ作用后，明顯降低RINm-5F細(xì)胞和Ad-eGFP預(yù)處理組RINm-5F細(xì)胞胰島

15、素釋放量(P＜0.01)，而Ad-rIGF-1預(yù)處理組與對照組胰島素釋放量差異無顯著性。
　　 4、培養(yǎng)上清中NO含量測定結(jié)果
　　 對照組、Ad-rIGF-1和Ad-eGFP轉(zhuǎn)染RINm-5F細(xì)胞組培養(yǎng)上清NO差異無顯著性(P＞0.05)；STZ作用后，STZ組和Ad-eGFP預(yù)處理組RINm-SF細(xì)胞NO產(chǎn)量明顯高于對照組(P＜0.05)；而Ad-rIGF-1預(yù)處理組能明顯抑制NO的產(chǎn)生，并與對照組差異無顯著性(P＞

16、0.05)。rIGF-1能夠阻止STZ誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生和釋放。
　　 5、rIGF-1對胰島β細(xì)胞凋亡的影響
　　 STZ組、Ad-eGFP+STZ組RINm-SF細(xì)胞凋亡率較對照組明顯增加(P＜0.01)；經(jīng)Ad-rIGF-1預(yù)處理的Ad-IGF-1+STZ組，可有效抑制STZ致細(xì)胞凋亡作用，細(xì)胞凋亡率與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 6、rIGF-1對胰島β細(xì)胞存活率的影響
　　 STZ組、

17、Ad-eGFP+STZ組RINm-SF細(xì)胞存活率較對照組明顯降低(P＜0.01)；而經(jīng)Ad-rIGF-1預(yù)處理的Ad-IGF-1+STZ組，RINm-5F細(xì)胞則可抵抗STZ的細(xì)胞毒性作用，細(xì)胞存活率與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。IGF-1可以明顯提高細(xì)胞存活率。
　　 結(jié)論：
　　 1、本研究成功構(gòu)建了高效表達(dá)大鼠胰島素樣生長因子1的重組腺病毒；
　　 2、從分子水平證明重組腺病毒Ad-rIGF-1能夠有

18、效表達(dá)；
　　 3、表達(dá)產(chǎn)物具有良好的生物學(xué)活性；
　　 4、大鼠胰島β細(xì)胞局部高表達(dá)rIGF-1能保護(hù)細(xì)胞功能，即胰島素合成釋放活性；
　　 5、大鼠胰島β細(xì)胞局部高表達(dá)rIGF-1能抑制鏈脲佐菌素引起細(xì)胞一氧化氮產(chǎn)生；
　　 6、大鼠胰島β細(xì)胞局部高表達(dá)rIGF-1能保護(hù)胰島β細(xì)胞免于誘導(dǎo)凋亡因子的損害；
　　 7、大鼠胰島β細(xì)胞局部高表達(dá)rIGF-1能提高細(xì)胞存活力和存活率；