1、背景和目的:
　　轉(zhuǎn)錄因子KLF2是一種重要的抑制性血管保護(hù)因子，可通過多種途徑抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的血管生成反應(yīng)，維持血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定。目前已發(fā)現(xiàn)血管生成在肝硬化門脈高壓(Portal Hypertention，PHT)中發(fā)揮重要作用，不僅影響肝內(nèi)血管重構(gòu)，而且促進(jìn)門脈側(cè)支血管生成，引起PHT的不斷進(jìn)展。因此，KLF2對(duì)改善門脈壓力有重要意義。目前關(guān)于KLF2在PHT及肝臟細(xì)胞中的研究甚少。已有研究表明，肝硬化時(shí)的內(nèi)皮細(xì)胞表型

2、部分是由血管保護(hù)因子的刺激調(diào)控的。他汀類藥物(statins)作為KLF2的誘導(dǎo)劑，可以引起下游舒血管因子的產(chǎn)量升高，降低門脈壓力。還有研究表示，PHT的動(dòng)物模型中，KLF2的表達(dá)上調(diào)。但是，關(guān)于KLF2在肝硬化PHT中的作用機(jī)制還未明確，KLF2對(duì)肝內(nèi)及肝外血管生成的調(diào)控，與HIF-1α、NF-κB的關(guān)系等，還需要更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明。本研究的目的是通過對(duì)PHT病人及動(dòng)物模型組織學(xué)及血清學(xué)標(biāo)本的檢測(cè)，篩選與KLF2升高相關(guān)的蛋白因子，

3、以此為依據(jù)研究KLF2調(diào)控血管生成的機(jī)制及信號(hào)通路，明確他汀類藥物上調(diào)KLF2表達(dá)并改善肝星狀細(xì)胞活化的作用機(jī)理，探討KLF2對(duì)病理性血管生成的作用及機(jī)制。
　　材料和方法:
　　(1)采集肝硬化PHT行脾切除斷流手術(shù)病人的門脈系統(tǒng)血管組織，以肝功能正常因膽結(jié)石行膽囊切除術(shù)病人的腸系膜血管組織作為對(duì)照組。收集病人的血清標(biāo)本。分別建立CCL4、門脈縮窄(Portal Vein Ligation，PVL)、膽總管結(jié)扎(Bile

4、Duct Ligation，BDL)三種PHT的動(dòng)物模型，并收集肝臟、十二指腸、門脈血管組織及脾腎靜脈分支血管(Splenorenal shunt，SRS)組織標(biāo)本。利用免疫組化、PCR以及western blot技術(shù)檢測(cè)人和動(dòng)物模型的組織標(biāo)本中VEGF、HIF-1α及KLF2的mnRNA和口蛋白表達(dá)水平，ELISA檢測(cè)血清標(biāo)本中VEGF, IL-8及PLGF分泌因子的表達(dá)水平。
　　(2)體外，對(duì)人肝星狀細(xì)胞予以TGF-β因子刺

5、激促進(jìn)其活化程度，同時(shí)用他汀類藥物上調(diào)KLF2的表達(dá)，transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Brdu增殖實(shí)驗(yàn)、PCR、western、ELISA檢測(cè)星狀細(xì)胞的活化能力及促血管生成信號(hào)通路中相關(guān)因子的變化。
　　(3)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞予以缺氧刺激，同時(shí)應(yīng)用慢病毒KLF2過表達(dá)顆粒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞，通過血管生成實(shí)驗(yàn)、transwell遷移實(shí)驗(yàn)、MTT增殖實(shí)驗(yàn)、westernblot、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的成血管相關(guān)改變，從而

6、確定KLF2對(duì)內(nèi)皮血管生成的作用。
　　結(jié)果:
　　(1) PHT時(shí)血管生成及KLF2表達(dá)情況:PHT病人的腸系膜血管組織中，VEGF及KLF2蛋白的表達(dá)升高。血清標(biāo)本中，VEGF、PLGF、IL-8分泌因子的表達(dá)無明顯變化。三種動(dòng)物模型結(jié)果顯示，VEGF在肝、腸及血管組織中高表達(dá);HIF-1α在肝臟及小腸組織中表達(dá)升高，而在脾腎靜脈分支血管組織中表達(dá)降低。與之對(duì)應(yīng)，KLF2在小腸中表達(dá)升高，在肝臟中表達(dá)無明顯變化。

7、　　(2)10ng/ml TGF-β刺激的HSC和對(duì)照組比較，細(xì)胞增殖效率增長(zhǎng)1.2倍;遷移效率增長(zhǎng)3倍;a-SMA的表達(dá)升高了大約兩倍。同時(shí)，KLF2的表達(dá)明顯上升。伴隨KLF2的表達(dá)升高，KLF2的下游靶蛋白一氧化氮合酶(eNOS)升高;核因子(NF-κB)、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)降低;HSC分泌干擾素(INF-Γ)增加。而聯(lián)合給予1uM的辛伐他汀后，HSC細(xì)胞的遷移和增殖效率降低了50％; a-SMA的表達(dá)有所降低;HSC細(xì)

8、胞中KLF2的表達(dá)增加了約4倍，eNOS表達(dá)有所下降;INF-Γ的分泌減少，以上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(3) KLF2對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞成血管的影響:缺氧刺激之后，對(duì)照組的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成速率，增值及遷移速率增高，而KLF2過表達(dá)的細(xì)胞中，上述細(xì)胞活化效應(yīng)均明顯降低;同時(shí)，缺氧刺激可上調(diào)HIF-1α及NF-κB的表達(dá)，而KLF2可抑制其表達(dá);KLF2下游促血管因子也有所下調(diào)，eNOS血管保護(hù)因子顯著上調(diào)。
　　結(jié)論:<

9、br>　　(1)在肝硬化PHT的病人及大鼠模型中，VEGF、HIF-1α等促血管生成因子的mRNA及蛋白的表達(dá)升高，與此同時(shí)，KLF2的表達(dá)升高。表明PHT患者體內(nèi)促血管生成反應(yīng)較對(duì)照組升高，并且可能和KLF2有關(guān)。
　　(2)他汀類藥物通過上調(diào)KLF2的表達(dá)，可抑制炎癥刺激的肝星狀細(xì)胞活化及成血管趨勢(shì)，并抑制下游的促血管因子的表達(dá)，從而抑制星狀細(xì)胞的促血管微環(huán)境。
　　(3)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)KLF2后，缺氧刺激導(dǎo)致的促