1、肌肉嫩度是影響肉質(zhì)品質(zhì)的重要因素，目前豬的育種工作將提高肌肉嫩度作為重要育種目標(biāo)之一。然而作為肌肉嫩度重要的候選基因Prdx6和Prdx2影響嫩度的分子機(jī)制尚不清楚。本文主要研究這兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，以及對(duì)肌肉、脂肪細(xì)胞分化的影響，從而探索其中的分子機(jī)制。主要的研究結(jié)果如下:
　　(1)分析了豬Prdx6基因組織表達(dá)譜，通過5'RACE確定了豬Prdx6基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，位于翻譯起始位點(diǎn)上游65bp處的腺嘌呤位點(diǎn)，將該位點(diǎn)定義為

2、+1。
　　(2)克隆了豬Prdx6基因的5'端上游調(diào)控序列1684bp，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)豬Prdx6啟動(dòng)子區(qū)，發(fā)現(xiàn)有很多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，并且近端有4個(gè)GC-box。對(duì)得分較高的肌肉脂肪發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ、MyoD、CREB及GC-box上的Sp1結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)序列在不同物種中的保守性也很高。通過6段缺失載體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)染三種真核細(xì)胞，確定了啟動(dòng)子的主要活性區(qū)域，然后通過該活性區(qū)域4段缺失載體的進(jìn)一步構(gòu)建，

3、轉(zhuǎn)染細(xì)胞，確定了該基因轉(zhuǎn)錄活性的最小單元為HSF結(jié)合位點(diǎn)。
　　(3)將轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ、MyoD、CREB、Sp1和HSF1與相應(yīng)的啟動(dòng)子載體共轉(zhuǎn)染，確定了這些轉(zhuǎn)錄因子均能提高Prdx6啟動(dòng)子活性，并通過定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。超表達(dá)各個(gè)轉(zhuǎn)錄因子后采用定量和Western的方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子和目的基因的表達(dá)量，確定了C/EBPβ和CREB能夠促進(jìn)Prdx6基因表達(dá)，干涉C/EBPβ和CREB可使Prdx6基因表達(dá)量下降。采用EM

4、SA和ChIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了C/EBPβ和CREB能夠結(jié)合到Prdx6基因的啟動(dòng)子區(qū)相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。通過免疫沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ與Prdx6在蛋白水平互作，而CREB與Prdx6不存在互作關(guān)系。
　　(4)分析了豬Prdx2基因組織表達(dá)譜，通過5RACE確定了豬Prdx2基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，位于ATG翻譯起始位點(diǎn)上游70bp處的鳥嘌呤位點(diǎn)。克隆了豬Prdx2基因的5'端上游調(diào)控區(qū)域共計(jì)2360bp，通過生物信息學(xué)分

5、析發(fā)現(xiàn)有許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并存在TATA框和GC-box。通過9段缺失載體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)染三種真核細(xì)胞，確定了啟動(dòng)子的主要活性區(qū)域，然后通過該活性區(qū)域4段缺失載體的進(jìn)一步構(gòu)建，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，確定了該基因的核心區(qū)域?yàn)門ATA框。
　　(5)通過定量的方法分析Prdx6和Prdx2基因在肌肉和脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)情況，確定了這兩個(gè)基因與肌肉脂肪細(xì)胞的分化有關(guān)。采用定量和Western的方法驗(yàn)證了超表達(dá)和干涉Prdx6基因后對(duì)C2C12

6、細(xì)胞分化標(biāo)志基因的影響。
　　(6)檢測(cè)了C2C12細(xì)胞分化不同時(shí)期細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量發(fā)現(xiàn)ROS水平隨細(xì)胞分化而逐漸升高。體外添加抗氧化劑NAC可以降低細(xì)胞分化中產(chǎn)生的ROS。通過超表達(dá)使內(nèi)源抗氧化物Prdx6水平升高也可以降低ROS含量，干涉使細(xì)胞內(nèi)Prdx6水平降低會(huì)使細(xì)胞ROS水平升高。
　　本研究分析了嫩度候選基因Prdx6和Prdx2的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，提出Prdx6基因通過與C/EBPβ互作或通過調(diào)控活性氧水平參