1、目的：凋亡是急性心梗中心肌細胞的損傷形式之一，可能導致梗死面積的擴大和繼發(fā)性心室重塑。信號素3A(Sema3A)是信號素家族（Semaphorins）的重要成員之一，其功能復雜涉及神經(jīng)排斥，細胞遷移，分化以及誘導凋亡等諸多方面。在這一實驗中，我們檢測了原代培養(yǎng)的心肌細胞中是否含有Sema3A，以及缺氧損傷后的心肌細胞Sema3A表達的改變，并通過慢病毒轉(zhuǎn)染改變心肌細胞Sema3A表達，研究了其對原代培養(yǎng)的心肌細胞凋亡的影響。
　　

2、 方法：使用原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞,分別進行30min，2h，5h，12h，24h缺氧(1％ O2)處理，通過實時熒光定量 PCR（Real time PCR）和蛋白免疫印跡法(Western Blot)兩種方式，檢測不同時間缺氧損傷對細胞Sema3A的表達的影響。設計構建能夠用于心肌細胞的過表達和抑制Sema3A表達的慢病毒，并通過實時熒光定量 PCR（Real time PCR）和蛋白免疫印跡法(Western Blot)對慢病毒效

3、果進行檢測。細胞分為對照組，空病毒組(只攜帶GFP)，過表達/抑制病毒組(既攜帶GFP,又攜帶目的基因)。過表達Sema3A病毒轉(zhuǎn)染后，蛋白免疫印跡法檢測Cleaved caspase-3表達，缺口末端標記法（Tunel）檢測凋亡率。抑制Sema3A病毒轉(zhuǎn)染后，經(jīng)過兩小時的缺氧處理，Western Blot檢測Cleaved caspase-3表達，Tunel檢測凋亡率。
　　 結果：①原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞中含有Sema3A。

4、發(fā)現(xiàn)不論是Mrna還是蛋白水平，隨著缺氧時間延長(0h/0.5h/2h/5h/12h/24h)，原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞的Sema3A表達逐漸下降（Mrna: 1.0vs0.900±0.273 vs0.721±0.128 vs0.497±0.112 vs0.072±0.024 vs0.058±0.020, 0.5h/2h P＞0.05, 5h/12h/24h P＜0.05;蛋白：0.451±0.130 vs0.450±0.101 vs0.

5、444±0.106 vs0.355±0.087 vs0.260±0.068 vs0.205±0.075，0.5h/2h/5h P＞0.05，12h/24h P＜0.05)。②構建的慢病毒能夠從Mrna和蛋白水平有效改變原代培養(yǎng)的心肌細胞Sema3A的表達（Mrna水平：過表達病毒轉(zhuǎn)染后，相對于對照組：空病毒組0.752±0.135，P＞0.05；過表達病毒組：33.670±3.840，P＜0.01；抑制病毒轉(zhuǎn)染后，相對于對照組：空病毒組

6、0.892±0.125，P＞0.05；抑制病毒組：0.179±0.052，P＜0.05），（蛋白水平：過表達病毒轉(zhuǎn)染后：對照組0.484±0.060；空病毒組：0.589±0.072，P＞0.05（相對于對照組）；過表達病毒組：1.003±0.130，P＜0.05（相對于對照組）；抑制病毒轉(zhuǎn)染后：對照組0.895±0.084；空病毒組：0.723±0.072，P＞0.05（相對于對照組）；抑制病毒組：0.373±0.032，P＜0.05

7、（相對于對照組））。③通過增加細胞Sema3A表達，Cleaved caspase-3表達上調(diào)（對照組：0.542±0.102；空病毒組：0.650±0.098；過表達病毒組：1.674±0.246，P＜0.05），細胞凋亡率顯著增加(對照組：0.672％±0.055％；空病毒組：0.854％±0.164％；過表達病毒組：23.458％±8.656％，P＜0.05）。抑制心肌細胞Sema3A的表達后進行缺氧2小時處理，Cleaved c

8、aspase-3表達下調(diào)（對照組：1.453±234；空病毒：1.567±0.431；Sema3A病毒：0.752±0.112，P＜0.05），細胞凋亡率下降(對照組：15.892％±1.342％；空病毒：17.620％±1.587％；Sema3A病毒：5.478％±0.958％，P＜0.05）。
　　 結論：我們的結果提示原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞能夠表達Sema3A,在受到缺氧損傷后，心肌細胞中Sema3A表達逐漸下調(diào)。我們在試