1、目的：原核表達(dá)細(xì)胞穿膜肽pep-1和病毒巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-Ⅱ（viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)的融合蛋白pep-1-vMIP-II，并檢測(cè)該融合蛋白是否具有穿透細(xì)胞膜從而發(fā)揮激活多種抗HIV-1基因表達(dá)上調(diào)的功能。為vMIP-II發(fā)展成為一種新型的、易于給藥的防治艾滋病新藥提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　 方法：以KSHV基因組為模板，PCR擴(kuò)增出vMIP-II的開放閱讀框。將化

2、學(xué)合成的細(xì)胞穿膜肽pep-1和vMIP-II基因克隆入原核表達(dá)載體pET15b，構(gòu)建原核表達(dá)載體的pET15b-pep-1-vMIP-II質(zhì)粒和對(duì)照載體pET15b-vMIP-II。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3)plysS，IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE和Western-blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物，Ni-NTA瓊脂親和層析純化回收目的蛋白。分別取10μg/mL的融合蛋白pep-1-vMIP-II和不含穿膜肽序列的對(duì)照組蛋白vMIP-I

3、I處理Hela細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡觀察該融合蛋白的穿膜功能。以200nmol/l的融合蛋白和對(duì)照蛋白同時(shí)分別處理HMEC-1細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞，收集細(xì)胞，抽提總RNA，熒光定量PCR檢測(cè)抗HIV基因（MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F）的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET15b-pep-1- vMIP-Ⅱ和pET15b-vMIP-II，DNA序列比對(duì)分析表明表達(dá)載體具有正確的序列

4、和閱讀框。表達(dá)并純化出可溶性pep-1- vMIP-Ⅱ融合蛋白及vMIP-Ⅱ蛋白。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示：融合蛋白pep-1-vMIP-II能穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，vMIP-Ⅱ蛋白不能進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。熒光定量PCR結(jié)果顯示：融合蛋白pep-1-vMIP-II能使Jurkat細(xì)胞中抗HIV基因MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F分別上調(diào)3.36、2.21、1.40、2.09、2.72倍；使HMEC-1細(xì)胞抗H

5、IV基因MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F分別上調(diào)57.80、158.63、97.29、2.18、2.43倍。vMIP-II蛋白能使Jurkat細(xì)胞中抗HIV基因MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F分別上調(diào)9.70、22.03、1.59、1.79、1.85倍；使HMEC-1細(xì)胞抗HIV基因MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F分別上調(diào)57.77、159.66、108