1、　　目的：本實(shí)驗(yàn)為課題―雷公藤甲素對(duì)同種異體軟骨細(xì)胞移植免疫排斥反應(yīng)作用的實(shí)驗(yàn)研究‖的前期實(shí)驗(yàn),目的是通過(guò)研究兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外二維及三維培養(yǎng)環(huán)境中增殖及代謝情況,為下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)篩選出最合適的種子細(xì)胞及回植體內(nèi)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的最佳時(shí)間點(diǎn)。
　　方法：取2周齡青紫藍(lán)兔,耳緣靜脈空氣栓塞處死,立即刮除兩側(cè)髖、膝關(guān)節(jié)周?chē)妹?采用無(wú)菌手術(shù)方式切取兩側(cè)股骨頭和股骨髁,隨即浸泡于 PBS液中,并移至超凈臺(tái),分離軟骨,用消毒好的剪刀將其

2、剪碎, II 型膠原酶消化獲取軟骨細(xì)胞；體外單層培養(yǎng)(不使用任何生長(zhǎng)因子),長(zhǎng)滿后傳代,倒置顯微鏡下觀察第1 代至第 5 代細(xì)胞形態(tài)的變化；樣品細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色,計(jì)數(shù)未著色細(xì)胞,求平均值,繪制每代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,判斷細(xì)胞的增殖能力；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)：以青紫藍(lán)兔半月板來(lái)源的纖維軟骨細(xì)胞分別作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照,檢測(cè)各代細(xì)胞 I 型膠原和Ⅱ 型膠原在基因水平的表達(dá)；三維環(huán)境下,采用Hoechst33258 DNA定量法

3、測(cè)定細(xì)胞在PLGA中的生長(zhǎng)增殖情況；GAG定量檢測(cè)來(lái)判斷軟骨細(xì)胞在支架材料上增殖和分化能力。
　　結(jié)果：貼壁的原代軟骨細(xì)胞呈橢圓形、多角形、多邊形,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),軟骨細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,至第4代,細(xì)胞由多角形逐漸向梭形轉(zhuǎn)變,即向成纖維細(xì)胞樣轉(zhuǎn)化；至第5代,細(xì)胞以梭形為主,細(xì)胞間間隙增大,胞質(zhì)不清,內(nèi)可見(jiàn)空泡。細(xì)胞的增殖能力隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸減小,秩和檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)：原代及第1、2代細(xì)胞與第3、4代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線間有差異

4、( P﹤0.05),與第5代細(xì)胞存在顯著性差異(P﹤0.01)。RT-PCR：在 I型膠原的檢測(cè)中,第 3代細(xì)胞的條帶亮度與第1、2代相比,明顯較強(qiáng),而第 4代細(xì)胞的亮度和陽(yáng)性對(duì)照幾乎一樣；在Ⅱ型膠原的檢測(cè)中,第4代細(xì)胞的條帶亮度較前3代明顯較暗。倒置顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞接種PLGA支架材料上1天后的情況,顯示出二者粘附性較好；應(yīng)用Hoechst33258 DNA定量法測(cè)定細(xì)胞在PLGA中的生長(zhǎng)增殖情況顯示：在接種以后,細(xì)胞即顯示出較強(qiáng)

5、的增殖能力,并維持 1 周左右,到第 10 天時(shí)趨于穩(wěn)定,第 14 天達(dá)到最高峰,而后少許回落,但與峰值相比無(wú)顯著性差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),單位 DNA 產(chǎn)生 GAG 的量呈增加的趨勢(shì),尤其是前兩周其增加幅度逐漸加大,至第17天達(dá)到峰值。
　　結(jié)論：?jiǎn)螌优囵B(yǎng)環(huán)境中,軟骨細(xì)胞從第3代已經(jīng)發(fā)生去分化,開(kāi)始表達(dá)纖維軟骨的 I型膠原,提示第 3代及其以后的細(xì)胞不適合做為種子細(xì)胞。第2代細(xì)胞既有很強(qiáng)的增殖能力,又保持了軟骨細(xì)胞的特異性表