1、研究背景：
　　肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一種惡性度非常高的實體腫瘤，侵襲轉(zhuǎn)移是其惡化發(fā)展的重要生物學特征，也是導(dǎo)致肝癌患者死亡的最主要原因。腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的多種因素、多機制參與的共同調(diào)控進程，現(xiàn)已證實上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial mesenchymal transition，EMT）是影響肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移進程的重要分子機制之一。端粒酶作為影響肝癌發(fā)展進程的關(guān)鍵性機

2、制酶，它的活性直接受端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（Human telomerase reverse transcriptase，hTERT）調(diào)控，hTERT作為維持端粒結(jié)構(gòu)及功能的關(guān)鍵性分子，最近研究發(fā)現(xiàn)其與腫瘤細胞EMT的發(fā)展進程密切相關(guān)。二十碳五烯酸（EPA）是n-3多不飽和脂肪酸的一員，前期研究發(fā)現(xiàn)其能夠抑制多種惡性腫瘤的進展，但現(xiàn)今對其抗癌效用的作用機制還不明確，尤其是EPA對肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響目前還未見報道。
　　研究目的：<

3、br>　　1.明確EPA對SMMC-7721肝癌細胞增殖及凋亡的影響；2.EPA能否逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細胞EMT；3.EPA能否影響EMT介導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移；4.探討hTERT在EPA影響EMT進程中的作用。
　　第一部分 EPA對SMMC-7721肝癌細胞增殖及凋亡的影響
　　不同濃度EPA(0、25、50、100、200、300、400μM)與TGF-β1（10 ng/m

4、l）共同干預(yù)人肝癌SMMC-7721細胞，檢測SMMC-7721肝癌細胞增殖與凋亡變化。
　　研究方法：
　　1.倒置顯微鏡下觀察SMMC-7721肝癌細胞生長；2.MTT檢測SMMC-7721肝癌細胞增殖率；3.流式細胞術(shù)檢測 SMMC-7721肝癌細胞凋亡；4.Western檢測SMMC-7721肝癌細胞Bax、Bcl-2蛋白表達。
　　實驗結(jié)果：
　　1.顯微鏡下初步觀察到EPA對SMMC-7721肝癌細胞

5、具有生長抑制效果；2.MTT檢測結(jié)果證實EPA干預(yù)后SMMC-7721肝癌細胞增殖率逐漸降低，且呈現(xiàn)出時間濃度依賴性；3.流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示EPA干預(yù)48 h后SMMC-7721肝癌細胞出現(xiàn)凋亡，且凋亡率與EPA濃度呈正相關(guān)；4.Western結(jié)果表明EPA干預(yù)48 h后SMMC-7721肝癌細胞促凋亡蛋白Bax表達上調(diào)而能夠下調(diào)抗凋亡Bcl-2蛋白的表達。
　　結(jié)論：
　　EPA能夠抑制 SMMC-7721肝癌細胞增殖

6、并促使其凋亡，且抑制效果具有時間濃度依賴性。
　　第二部分 EPA對TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響
　　10 ng/ml TGF-β1刺激SMMC-7721肝癌細胞，誘導(dǎo)SMMC-7721肝癌細胞發(fā)生EMT。用50μM、200μM EPA干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細胞檢測其侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化。
　　研究方法：
　　1.倒置顯微鏡下觀察人肝癌 SMMC-7721細胞

7、形態(tài)的改變；2.Western檢測SMMC-7721肝癌細胞E-cadherin、N-cadherin蛋白表達；3.劃痕實驗檢測SMMC-7721肝癌細胞遷移率；4.Transwell檢測 SMMC-7721肝癌細胞侵襲率；5.ELISA檢測SMMC-7721肝癌細胞MMP-2、MMP-9表達。
　　實驗結(jié)果：
　　1.顯微鏡下初步觀察到 EPA能夠抑制 TGF-β1誘導(dǎo)的 SMMC-7721肝癌細胞EMT；2.Wester

8、n結(jié)果驗證了EPA能夠逆轉(zhuǎn) TGF-β1誘導(dǎo)的 SMMC-7721肝癌細胞EMT；3.劃痕實驗證實EPA能夠明顯降低TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細胞的遷移能力，且抑制效果存在時間濃度依賴；4.Transwell實驗證實 EPA能夠明顯降低TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細胞的侵襲能力，且抑制效果也存在時間濃度依賴；5.ELISA檢測結(jié)果表明EPA能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶M

9、MP-2和MMP-9。
　　結(jié)論：
　　10 ng/ml TGF-β1能夠誘導(dǎo)SMMC-7721肝癌細胞發(fā)生EMT。EPA可以逆轉(zhuǎn)TGF-β1介導(dǎo)的EMT，并抑制SMMC-7721肝癌細胞MMP-2和MMP-9的分泌從而降低其侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　第三部分 EPA對TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細胞端粒酶活性的影響
　　50μM、200μM EPA作用于TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細胞，檢測S

10、MMC-7721肝癌細胞端粒酶的活性及端粒酶調(diào)控蛋白hTERT的表達。
　　研究方法：
　　1.ELISA檢測人肝癌SMMC-7721細胞端粒酶活性；2.Western檢測SMMC-7721肝癌細胞hTERT蛋白表達；3.Real-time PCR檢測SMMC-7721肝癌細胞hTERT mRNA表達；4.細胞免疫熒光法觀察SMMC-7721肝癌細胞hTERT熒光強度。
　　實驗結(jié)果：
　　1.EPA能夠抑制TG

11、F-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細胞的端粒酶活性，且抑制效果具有時間濃度依賴性；2.EPA能夠明顯降低TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細胞hTERT蛋白表達；3.EPA能夠明顯降低TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細胞hTERT mRNA表達；4.細胞免疫熒光結(jié)果顯示EPA能夠降低TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細胞hTERT熒光強度。
　　結(jié)論：
　　EPA能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-77