1、血液血管干細胞（hemangioblast）是一種具有雙向分化潛能的干細胞，在體內外發(fā)育的過程中，能夠分化成為造血細胞和內皮細胞。血液血管干細理論已經通過在胚胎干細胞分化模型中得到驗證，即胚胎干細胞經2.5-3.5天分化為擬胚體，再在特殊的分化體系中可以形成一種特殊的Blast樣集落，其具有同時分化產生內皮細胞和造血細胞的能力，這種形成Blast樣集落的細胞被稱為BL-CFC（the blast colony-forming cell）

2、。近年來，血液血管干細胞在起源、分子生物學特點、體外誘導分化等方面的研究取得了較大進展。既往研究發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎定向造血的起源部位AGM區(qū)亦存在類似血液血管干細胞的前體HPP-HA。之后在小鼠胚胎AGM區(qū)同樣發(fā)現(xiàn)了BL-CFC的存在，建立了特殊的的血液血管干細胞模型，此模型已被應用于研究小鼠AGM區(qū)血液血管干細胞的發(fā)育和調控，如經典的造血生長因子IL-3也可以促進血液血管干細胞的發(fā)育和分化。然而，鑒于血清培養(yǎng)體系營養(yǎng)成分復雜，不利于精細研究

3、某些細胞因子對血液血管干細胞的真實作用。因此，本研究在小鼠胚胎AGM區(qū)已建立的BL-CFC模型的基礎上，建立了一個BL-CFC的無血清孵育培養(yǎng)模型，優(yōu)化了常規(guī)的BL-CFC培養(yǎng)體系，并在此基礎上，研究造血發(fā)育相關因子對小鼠AGM區(qū)血液血管干細胞的調節(jié)作用。
　　 本研究首先在小鼠胚胎AGM區(qū)建立了BL-CFC的無血清孵育培養(yǎng)模型。取E10.5小鼠胚胎AGM區(qū)，消化成單細胞，在無血清培養(yǎng)體系下孵育12h后進行半固體集落培養(yǎng)。在bF

4、GF、SCF、VEGF、IL-6、IGF-I和LIF細胞生長因子的共同作用下培養(yǎng)3-3.5天后，可見一種特殊形態(tài)的集落開始出現(xiàn)，其形態(tài)和分化特征與E9.5-12.5小鼠胚胎AGM區(qū)來源的Blast集落相似。然后進行BL-CFC造血及內皮分化功能鑒定。集落培養(yǎng)4-5天后，挑取單個集落進行造血集落培養(yǎng)。所有的BL-CFC可產生CFU-E、CFU-GM、CFU-Mix等一種或多種造血集落。貼壁細胞換EGM2內皮細胞完全培養(yǎng)基繼續(xù)進行誘導，第7

5、-10天時可見貼壁細胞中有大量鵝卵石樣內皮細胞以及少量成熟的造血細胞。隨后進行體外成血管功能檢測，結果表明：貼壁細胞高比例的吞噬LDL；體外Matrigel上可形成血管樣結構，呈網(wǎng)絡狀生長。同時，將BL-CFC在OP9基質細胞上進行造血和內皮細胞分化功能檢測。挑取單個Blast集落，接種于OP9基質細胞上培養(yǎng)7-10天后，所有集落在OP9上均顯示造血細胞的分化潛能（CD45陽性），30％的HA在OP9上可以形成CD31陽性的管樣結構。<

6、br>　　 接下來，研究了三種與造血發(fā)育相關的細胞因子IL-3、SCF和NGF對小鼠胚胎AGM區(qū)細胞的調節(jié)作用。將上述3種細胞因子與AGM區(qū)細胞分別在SR及FBS體系下體外共孵育12小時后進行BL-CFC接種，結果顯示IL-3在兩種體系下均能擴增BL-CFC，而NGF在兩種體系下對BL-CFC均無作用，SCF只在SR體系中對BL-CFC有明顯的擴增作用。
　　 綜上，本研究在小鼠胚胎AGM區(qū)建立了BL-CFC的無血清孵育培養(yǎng)模