1、研究背景:
　　 隨著社會的發(fā)展，創(chuàng)傷性腦損傷（Traumatic brain injury, TBI）已逐漸成為當(dāng)今社會公共衛(wèi)生的一個重要問題，其突出特點(diǎn)為高發(fā)生率、高致殘率以及高死亡率，目前已成為兒童和青壯年致殘和致死的主要原因之一。統(tǒng)計表明15％-20％的死亡者年齡在5-35歲之間。TBI的原因大多為交通事故，其次為墜落傷和斗毆，且高速公路交通事故呈上升趨勢。我國去年因車禍致死者約10萬人，顱腦損傷居其首位。TBI是神經(jīng)外

2、科中最常見的疾病，有著較高的致殘率和致死率。隨著對顱腦損傷基礎(chǔ)研究的不斷進(jìn)展，不少新理論、新方法、新技術(shù)已應(yīng)用于臨床救治工作中。
　　 TBI根據(jù)時間可分為原發(fā)性與繼發(fā)性腦損傷兩種。原發(fā)性損傷往往即刻發(fā)生并難以避免，而繼發(fā)性損傷則發(fā)生于TBI后數(shù)小時至數(shù)天內(nèi)。前者主要發(fā)生在外力作用的同時，如頭皮撕裂、顱骨骨折、腦挫裂傷、彌漫性軸突損傷等;后者的損傷機(jī)制比較復(fù)雜，包括腦水腫、氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞代謝紊亂、腦缺血、腦腫脹、炎癥反應(yīng)、氧

3、自由基及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等，病理變化表現(xiàn)多種多樣。本文主要對部分繼發(fā)性腦損傷機(jī)制進(jìn)行研究。
　　 TBI后可繼發(fā)細(xì)胞代謝紊亂等復(fù)雜的病理生理反應(yīng)，開始時可引發(fā)短暫的糖代謝升高，腦組織的糖利用率開始下降，繼而出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)乳酸堆積等一系列病理變化，導(dǎo)致細(xì)胞中毒、壞死或凋亡，最終導(dǎo)致細(xì)胞毒性腦水腫。酮體則是此過程中腦組織供能的主要燃料。正常腦組織主要由糖代謝來提供能量，但在功能不足或需求增加時，腦組織可以利用酮體，以代償細(xì)胞代謝的變化，并

4、且不同年齡時期對酮體的利用率也不同。酮體的神經(jīng)保護(hù)作用已在神經(jīng)退行性病變、腦缺血、癲癇以及創(chuàng)傷性顱腦損傷等多種病理情況下得到證實(shí)，但對生酮飲食(ketogenic diet，KD)在TBI后的作用研究鮮有報道，且其作用機(jī)制尚不清楚。
　　 核因子2-相關(guān)因子2(Nuclear factor-E2-related factor2，Nrf2)是一種抗氧化反應(yīng)的主調(diào)節(jié)器，能誘導(dǎo)保護(hù)性反應(yīng)基因，激活人體自身的保護(hù)性反應(yīng)，從而抵御廣譜的毒

5、性物質(zhì)和致病原對細(xì)胞的損傷。在正常或無應(yīng)激條件下，Nrf2存在于細(xì)胞質(zhì)中，與胞質(zhì)接頭蛋白(Kelch-like ECH-associated protein1，Keap1)結(jié)合在一起，無生物活性。當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激時，Nrf2與Keap1分開，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，并與抗氧化基因的啟動區(qū)域抗氧化元件(Antioxidant Response Element，ARE)結(jié)合，啟動抗氧化反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄并表達(dá)相關(guān)抗氧化蛋白。Nrf2介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)無細(xì)胞特

6、異性和器官特異性，已證實(shí)Nrf2可保護(hù)肺臟、肝臟、消化道、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等多器官或組織。創(chuàng)傷性顱腦損傷后Nrf2的腦保護(hù)作用已有許多研究，Nrf2可激活抗氧化反應(yīng)，減輕腦水腫及抗凋亡等諸多作用。
　　 研究目的:
　　 目前仍無明顯有效的方法降低創(chuàng)傷性顱腦損傷的死亡率。顱腦損傷救治的最終目的是降低致死率和致殘率，并提高患者的生存質(zhì)量。要達(dá)到這一目的，并非依靠單一的某種藥物或某種措施即能達(dá)到，而需要一種綜合治療，即整

7、個治療過程中任何環(huán)節(jié)的疏漏均可導(dǎo)致最終治療結(jié)果的不良。本實(shí)驗通過研究生酮飲食對創(chuàng)傷性顱腦損傷后皮層Nrf2活性及下游抗氧化因子HO-1含量的影響，進(jìn)一步明確生酮飲食在TBI后神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制，為TBI的治療提供新的思路及理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 將48只出生后35天，重量約120g的SD大鼠隨機(jī)分成4個組:假手術(shù)+正常飲食組（Sham+ND，n=12）、假手術(shù)+生酮飲食組（Sham+KD，n=12）、外傷+正常飲

8、食組(TBI+ND，n=12)、外傷+生酮飲食組(TBI+KD，n=12)。采用Feeney's自由落體模型裝置制作大鼠TBI模型:戊巴比妥麻醉大鼠，于右側(cè)距冠狀縫及中線2.5mm處開骨窗，用40g砝碼在10cm高度自由落下，垂直打擊。假手術(shù)組只做開窗，不做垂直打擊。模型制作好24小時后開始分別給予生酮飲食和正常飲食，一周后處死動物，期間無動物死亡，各組隨機(jī)取6只大鼠損傷灶周圍5mm內(nèi)的腦組織一部分保存于-80℃冰箱，用于檢測Nrf2活

9、性及含量和HO-1含量，取各組剩余6只大鼠的整腦即刻用于檢測腦組織含水量。
　　 1.干濕比重法測定腦組織含水量
　　 根據(jù)公式:（濕重—干重）/濕重×100％計算腦組織含水量百分比
　　 2.凝膠電泳遷移率實(shí)驗(EMSA)檢測Nrf2活性
　　 取1.75pmol/μl未標(biāo)記的雙鏈Nrf2核苷酸探針(5'-TTTTATGCTGTGTCATGGTT-3'，5'-AACCATGACACAGCATAAAA-3

10、')和T4多核苷酸激酶，用[γ-32P]-ATP進(jìn)行標(biāo)記，總反應(yīng)體積為10μl（包括60μg核蛋白，Nrf2探針1μl，2μl緩沖液，余為自由水），混勻后4℃放置20min，然后上樣至已制好的聚丙烯酰胺凝膠樣品孔中，恒壓120V，電泳2小時。電泳結(jié)束后取下凝膠，放入暗盒中-80℃曝光、顯影，采用Image J圖像分析軟件測量灰度值。
　　 3.Western blot檢測Nrf2核蛋白及HO-1蛋白的含量
　　 取約10

11、0mg標(biāo)本研磨，加入細(xì)胞裂解液分別提取核蛋白和胞漿蛋白，并用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。將提取好的核蛋白及胞漿蛋白煮沸3分鐘后上樣至已制好的聚丙烯酰胺凝膠孔中，以恒壓90V電泳，直至溴酚藍(lán)接近膠的下邊緣，電泳結(jié)束后再將聚丙烯酰胺上的蛋白轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維膜上，封閉1小時，TTBS溶液漂洗3次后分別加入相應(yīng)一抗，4℃孵育1小時，TTBS溶液洗膜3次，再加二抗，4℃孵育，1小時后用TTBS溶液洗膜3次，加入ECL發(fā)光劑，放置暗盒曝光，顯影

12、，采用Image J圖像分析軟件測量灰度值。
　　 4.RT-PCR檢測HO-1mRNA表達(dá)水平
　　 取約50mg標(biāo)本研磨，分別加入1 ml Trizol，室溫靜置5min，再加0.2 ml氯仿充分震蕩，4℃離心15min，取上清液，再加0.5 ml異丙醇，輕輕混勻后放置10min，離心10min，吸去上清液，加入1ml75％酒精，離心5min，吸去酒精，晾干，加DEPC水溶解，測定RNA濃度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將R

13、NA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別加入上、下引物及聚合酶，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物加入已制好的瓊脂糖凝膠孔中電泳，電泳完畢后將瓊脂糖凝膠放置凝膠成像儀中成像，采用Image J圖像分析軟件測量灰度值。
　　 5.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。定量資料結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x-)±s）表示。多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩組間均數(shù)的多重比較，當(dāng)方差齊同時用LSD檢驗，當(dāng)方差不齊時用Tamha

14、ne's T2檢驗。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.腦組織含水量的變化:分別給予TBI組的大鼠生酮飲食和正常飲食一周后，各組間均數(shù)采用單因素方差分析，P＜0.001生酮飲食組腦水腫程度較正常飲食組腦水腫明顯減輕，分別是（79.55±0.41）％和（81.15±1.16）％，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。
　　 2.腦組織胞核中Nrf2活性的變化:正常大鼠分別用正常飲食和生酮飲食飼

15、養(yǎng)一周后，生酮飲食組Nrf2的活性較正常飲食組高(P＜0.001)，顱腦創(chuàng)傷并給予一周生酮飲食后，同樣較創(chuàng)傷后給予正常飲食組高(P＜0.001)。
　　 3.腦組織胞核中Nrf2蛋白含量及胞漿蛋白HO-1的含量:給予生酮飲食和正常飲食一周后，生酮飲食組胞核Nrf2含量均較正常飲食組高(P＜0.001)，并且HO-1蛋白含量同樣升高(P=0.002)。
　　 4.腦組織中HO-1mRNA水平變化:四組大鼠分別給予生酮飲食和

16、正常飲食一周后，生酮飲食組HO-1mRNA的表達(dá)均較正常飲食組高(P=0.001，P＜0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 氧化應(yīng)激損傷是創(chuàng)傷性顱腦損傷后繼發(fā)性腦損傷的重要原因，因此抗氧化應(yīng)激對神經(jīng)保護(hù)具有重要作用。生酮飲食可在創(chuàng)傷性顱腦損傷后減輕腦水腫，抑制細(xì)胞凋亡及抗氧化作用等。本實(shí)驗結(jié)果表明生酮飲食可明顯激活Nrf2，使之轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，繼而轉(zhuǎn)錄表達(dá)下游抗氧化蛋白HO-1，故我們認(rèn)為創(chuàng)傷性顱腦損傷后，生酮飲食可能通過激