1、藥物代謝研究在藥物研究與開發(fā)中占有舉足輕重的地位,中藥活性成分代謝的研究近年來越來越多地引起人們的關注。本論文以傳統(tǒng)中藥川芎為對象,提取其中的揮發(fā)油,并分析其化學成分,比較幾種提取方法所得揮發(fā)油化學組成成分上的差異；從揮發(fā)油中分離純化制備得到主要有效成分藁本內(nèi)酯單體的對照品；建立了HPLC法測定揮發(fā)油以及生物樣品中藁本內(nèi)酯的含量；并應用此方法研究了口服給以川芎揮發(fā)油后,藁本內(nèi)酯在小鼠和大鼠體內(nèi)的藥動學動態(tài)變化過程以及生物轉化情況；研究了

2、藁本內(nèi)酯在小鼠體內(nèi)各組織間的分布特性；同時還建立了LC-ESI-MS法測定肝微粒體孵育液中的藁本內(nèi)酯,并應用該方法開展了藁本內(nèi)酯在肝微粒體中的體外代謝研究；研究結果顯示藁本內(nèi)酯在體內(nèi)和體外存在生物轉化,且有一定的差異。 本論文通過上述研究,豐富了中藥藥物代謝和藥動學的研究內(nèi)容,為臨床合理用藥提供了理論的參考,為中藥現(xiàn)代化研究進行了有利的探索。 藥物代謝動力學研究在藥物的研究開發(fā)和合理應用中具有極其重要的意義,對中藥活性成

3、分的代謝動力學研究,近幾年來也引起了人們的廣泛重視。中藥代謝動力學研究的內(nèi)容非常豐富,生物樣本成分復雜,測定的目標有效成分濃度非常低,干擾物質多,既存在內(nèi)源性物質的干擾,又有主要代謝產(chǎn)物的干擾,還有中藥中其他成分的干擾。然而,隨著分子生物學技術以及現(xiàn)代儀器分析技術的迅速發(fā)展,新的檢測技術不斷的出現(xiàn),給中藥藥代動力學研究提供了高靈敏度、高精密的、高準確度的分析檢測手段,推動了中藥藥代動力學的發(fā)展。中藥活性成分的代謝研究對中藥作用機理探討、

4、中藥新劑型研發(fā)、中藥質量評價和中藥的臨床應用等等,均具有指導意義和推動作用,已經(jīng)成為中藥現(xiàn)代化研究的重要切入點。 本論文分為5個部分,研究了中藥川芎揮發(fā)油的提取、主要有效成分的分離、有效成分的藥動學研究、組織間分布研究以及其體外代謝的影響因素研究和酶促反應動力學研究。 第一部分 川芎揮發(fā)油的提取、物理參數(shù)測定及化學成分分析 目的：從川芎藥材中提取揮發(fā)油,并測定其物理參數(shù),分析其中的化學成分。 方法：用經(jīng)典

5、的水蒸汽蒸餾法從粉碎的川芎藥材中提取揮發(fā)油；采用比重瓶法測定其密度；應用阿貝氏折光儀測定折光率；并用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀研究其中的化學成分。 結果：水蒸汽蒸餾法提取川芎揮發(fā)油的產(chǎn)率為0.4％,測定川芎揮發(fā)油密度為0.9083g/mL,折光率為1.5331。GC-MS法測定得該揮發(fā)油中含有29種成分,其中以藁本內(nèi)酯含量最多,其次是正丁烯基苯酞、丁基苯酞、α-萜品醇。 第二部分 藁本內(nèi)酯單體的分離純化及結構鑒別 目的

6、：從川芎揮發(fā)油中分離純化藁本內(nèi)酯單體,鑒定其結構,并考察其穩(wěn)定性,以選擇合適的儲存條件。 方法：用玻璃柱層析法分離揮發(fā)油中的藁本內(nèi)酯單體,以硅膠為固定相,用石油醚(30～60℃)：乙酸乙酯(100:1)洗脫。運用薄層色譜法結合高效液相色譜法監(jiān)測流分,合并含單一成分的組分,并揮干溶劑后,得到的化合物進行紫外吸收光譜、紅外吸收光譜、核磁共振光譜和質譜分析,鑒定其結構。用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀測定該藁本內(nèi)酯的含量,并對其進行不同儲存條件

7、下的穩(wěn)定性考察。 結果：用硅膠柱層析法制備得到藁本內(nèi)酯單體,經(jīng)過四大光譜的結構鑒別,確定為Z-藁本內(nèi)酯,純度為98.65％。并由4種儲存條件下藁本內(nèi)酯穩(wěn)定性考察結果顯示,溫度是影響藁本內(nèi)酯穩(wěn)定性的主要因素,將藁本內(nèi)酯置于-20℃冷凍保存即能保持其基本穩(wěn)定,18個月的降解率為1.26％。 第三部分 口服川芎揮發(fā)油后藁本內(nèi)酯的代謝動力學研究 目的：建立生物樣品中藁本內(nèi)酯含量測定的高效液相色譜法,并將其應用于藁本內(nèi)酯在

8、小鼠和大鼠體內(nèi)的藥動學研究。 方法：生物樣品用正己烷直接萃取濃縮后,注入高效液相色譜儀,以尼莫地平為內(nèi)標,選擇Kromasil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,預柱為Pelliguard TM LC-18,以乙腈-10％異丙醇水溶液(58:42)為流動相,流速為1.0 mL/min,在室溫下,于324 nm處進行分析測定,用內(nèi)標法計算含量。數(shù)據(jù)用DAS軟件的雙峰模塊進行分析處理,并擬合藥動學參數(shù)。

9、結果：由藥時曲線可見,藁本內(nèi)酯進入體內(nèi)后吸收迅速,達峰時間短,且藥時曲線出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象。DAS軟件擬合的結果顯示,藁本內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的t1/2為182 min,小鼠體內(nèi)為106 min。由此說明藁本內(nèi)酯在體內(nèi)的消除較快,滯留時間較短。 第四部分 口服川芎揮發(fā)油后藁本內(nèi)酯的組織分布特性研究 目的：建立適用于測定小鼠各組織中藁本內(nèi)酯的含量的HPLC法,并研究口服川芎揮發(fā)油后藁本內(nèi)酯在小鼠體內(nèi)各組織間的分布特性。 方法：

10、生物樣品用正己烷直接萃取濃縮后,注入高效液相色譜儀,以尼莫地平為內(nèi)標,選擇Kromasil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,預柱為PelliguardTM LC-18,以乙腈-10％異丙醇水溶液為流動相,流速為1.0 mL/min,在室溫下,于324 nm處進行分析測定,用內(nèi)標法計算含量。分別考察小鼠給以川芎揮發(fā)油后10 min、1 h、10 h時血漿及各組織中的藁本內(nèi)酯含量情況。 結果：藁本內(nèi)酯與內(nèi)標物尼

11、莫地平保留時間分別為7.2 min和5.9 min,藁本內(nèi)酯在各組織中一定濃度范圍內(nèi)線性關系良好,各組織中低、中、高濃度的回收率及精密度均符合方法學要求。藁本內(nèi)酯在小鼠體內(nèi)各主要效應器官之間分布特性是C肺>C心>C腦,在主要消除器官為C肝>C脾>C腎。在血漿和肝臟中藁本內(nèi)酯存在生物轉化。 第五部分 藁本內(nèi)酯在肝微粒體中體外代謝的初步研究 目的：建立測定肝微粒體孵育液中藁本內(nèi)酯含量的高效液相色譜-質譜聯(lián)用法,進行藁本內(nèi)酯體

12、外代謝影響因素的研究,并考察藁本內(nèi)酯的酶促反應動力學。 方法：于肝微粒體溫孵液中加入等體積的冰冷的甲醇,以終止反應同時沉淀其中的蛋白。取高速離心后的上清液適量,注入高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀,以尼群地平為內(nèi)標,測定其中藁本內(nèi)酯的含量?？疾鞙胤鯐r間、酶蛋白濃度、底物濃度對藁本內(nèi)酯體外代謝的影響,并確定最佳溫孵條件,進行酶促反應動力學研究,測定酶促反應動力學參數(shù)。通過六種同工酶的特異性抑制實驗,確定參與藁本內(nèi)酯代謝的主要同工酶。