1、第一部分重組腺病毒介導的缺氧誘導因子-1α基因抗大腦皮層神經(jīng)元缺氧的研究
　　目的：探討重組腺病毒介導的缺氧誘導因子-1α基因對大鼠大腦皮質神經(jīng)元缺氧后的保護作用，為臨床治療缺血缺氧性腦血管病提供更多的實驗依據(jù)。
　　方法：制備大鼠大腦皮層神經(jīng)元體外原代培養(yǎng)及缺氧的模型；倒置顯微鏡下觀察正常和缺氧神經(jīng)元的生長情況；免疫細胞化學鑒定大鼠大腦皮層神經(jīng)元；將帶有綠色熒光蛋白（Green fluorescence protein，G

2、FP）的重組腺病毒介導的缺氧誘導因子-1α基因（Recombinant adenovirus-mediated hypoxia inducible factor-1 alpha gene，AdHIF-1α）及重組腺病毒空載體（Recombinant adenovirus empty vector，Ad）轉染缺氧的神經(jīng)元，并分5個時間點（12h，24h，48h，72h及96h）在熒光顯微鏡下觀察 AdHIF-1α及 Ad的轉染效率；將實驗

3、神經(jīng)元分為正常對照（Normoxia）組、缺氧（Hypoxia）組、 AdHIF-1α轉染組及 Ad轉染組，透射電鏡下觀察各實驗組神經(jīng)元超微結構的變化。
　　結果：（1）神經(jīng)元的原代培養(yǎng)：初種神經(jīng)元2h開始貼壁，48h后可見大部分細胞貼壁，細胞形態(tài)比較單一，呈圓球形，偶見細胞長出突起。第5天神經(jīng)元中混雜有較多的膠質細胞，換 N2培養(yǎng)液抑制雜質細胞的生長，培養(yǎng)至第11天，神經(jīng)元生長旺盛，純化率達95％以上。（2）免疫細胞化學鑒定：取

4、培養(yǎng)至第11天的神經(jīng)元，加入小鼠神經(jīng)絲（Neurofilament，NF）抗體，二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）染色，光鏡下NF陽性神經(jīng)元的細胞質和突起呈棕色或棕褐色，細胞核深染，形態(tài)呈圓形、圓錐形，從胞體伸出突起，并與周圍細胞連接，突起多為單極或雙極，證實所培養(yǎng)的細胞為皮層神經(jīng)元。（3）缺氧模型的建立：將用于實驗的神經(jīng)元換用含100μmol/LCoCl2及2%胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)B

5、S）的DMEM培養(yǎng)液分別繼續(xù)培養(yǎng)12h，24h，48h及72h，經(jīng)過形態(tài)學觀察和缺氧模型預實驗，證實缺氧24h適合用作缺氧模型。（4）熒光顯微鏡下觀察AdHIF-1α及Ad的轉染效率：AdHIF-1α及Ad轉染缺氧的神經(jīng)元后，12h可見有少許熒光開始表達，24h熒光表達稍增加，48h熒光表達最明顯，72h熒光表達下降，96h熒光表達微弱。（5）神經(jīng)元超微結構變化的觀察：透射電鏡下Normoxia組神經(jīng)元形態(tài)及染色質正常、內質網(wǎng)、線粒體等

6、結構正常；Hypoxia組及 Ad組細胞水腫，細胞器破壞或消失；AdHIF-1α組細胞核形態(tài)結構及染色質分布未見明顯異常，細胞器以線粒體、內質網(wǎng)為主，個別略顯水腫。證實AdHIF-1α可改善缺氧對神經(jīng)元細胞器的損傷，維持細胞結構的完整性。
　　結論：（1）本實驗研究所建立的大鼠大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)模型及缺氧模型是成功的，可用于腦缺血缺氧性疾病的體外實驗的研究；（2）AdHIF-1α可顯著改善缺氧后損傷神經(jīng)元的超微結構，對缺氧后的

7、神經(jīng)元具有保護作用。
　　第二部分Western blot法定量檢測AdHIF-1α及Ad轉染缺氧神經(jīng)元后各組神經(jīng)元中HIF-1α、EPO及VEGF蛋白的表達
　　目的：探討重組腺病毒介導的缺氧誘導因子-1α基因對大腦皮質神經(jīng)元缺氧的保護作用機制，為臨床治療缺血缺氧性腦血管病提供新的治療思路。
　　方法：蛋白質印跡（Western blot）法觀察正常對照（Normoxia）組、缺氧(Hypoxia)組、重組腺病毒介導

8、的HIF-1α基因(Recombinant adenovirus-mediated hypoxia-inducible factor-1 alpha gene，AdHIF-1α）轉染組及重組腺病毒空載體(Recombinant adenovirus empty vector，Ad)轉染組神經(jīng)元中缺氧誘導因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α）、促紅細胞生成素（Erythropoieti

9、n，EPO）及血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白的定量表達變化。
　　結果：AdHIF-1α轉染組HIF-1α、EPO、VEGF蛋白12h開始表達，24h表達增加，48h達高峰，72h下降，與缺氧組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)，Ad組與缺氧組相比無統(tǒng)計學意義。
　　結論：（1）正常的神經(jīng)元中含有少量的HIF-1α基因，缺氧后HIF-1α基因