1、目的：CD4為重要的淋巴細胞表面分子，屬于免疫球蛋白家族膜錨定蛋白，與MHC-Ⅱ類分子結合，參與Th細胞TCR識別抗原的信號轉導，產生相關免疫應答。草魚是我國主要養(yǎng)殖魚類，也是低等脊椎動物中硬骨魚類的代表物種，對其免疫系統(tǒng)的研究有助于了解免疫系統(tǒng)的多樣性以及脊椎動物免疫系統(tǒng)的進化，也可為水產養(yǎng)殖動物的病害防治提供理論依據(jù)。本研究旨在制備抗草魚CD4L-2單克隆抗體，并分選出CD4L-2+細胞，為T細胞亞群分類及其功能研究奠定基礎。

2、>　　方法：基于轉錄組測序獲得的草魚CD4L-2基因信息設計特異引物，采用PCR技術分離草魚腸道CD4L-2基因;應用qPCR方法分析草魚CD4L-2基因的表達譜。原核表達抗原性較強的CD4L-2胞外段蛋白，以重組蛋白免疫小鼠獲多抗;雜交瘤技術制備相應的mAb，并利用CIK細胞間接免疫熒光、Western blot、間接ELISA等方法檢測其特異度與效價。采用Protein G親和色譜法純化抗草魚CD4L-2的mAb，IAC技術純化獲得

3、CIK細胞內靶蛋白，質譜分析靶蛋白與預測的草魚CD4L-2蛋白的一致性。應用流式細胞術分選檢測用PHA刺激草魚前后的各免疫相關組織中CD4L-2+細胞比例變化特征;激光共聚焦鑒定草魚腸粘膜中表達CD4L-2基因的細胞類型。
　　結果：草魚CD4L-2基因的ORF長1290 bp，編碼429個氨基酸，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質區(qū)三部分。胞外區(qū)含有3個Ig樣結構域(V1-C1-C2)，胞質區(qū)包含保守的CXC基序。該CD4L-2分子胞外區(qū)

4、存在多個保守性位點，如C1結構域中的WTC基序以及V1、C1和C2結構域中的N糖基化位點等。系統(tǒng)進化樹分析顯示，草魚CD4L-2與斑馬魚、日本關東鯽、斑點叉尾鲴等魚類的親緣關系較近，草魚CD4L-2基因表達于各種組織，表達量從高到低的順序為血液、體腎、心臟、頭腎、腸道、脾臟、鰓、胸腺、肝臟、鰭、肌肉、表皮等組織，也表達于腎細胞(CIK)中。獲得的抗草魚CD4L-2多抗與單抗的效價分別為1∶64000與1∶160000（雜交瘤細胞的保藏號

5、為:CCTCC C2015189）。CIK細胞間接免疫熒光與Western blot分析結果顯示，所制備的抗草魚CD4L-2單克隆抗體能特異性識別自然狀態(tài)下折疊的CD4L-2蛋白。質譜分析顯示，靶蛋白與預測的草魚CD4L-2蛋白的一致性可達66％。健康草魚多數(shù)組織中含有CD4L-2+細胞，其在組織細胞中的百分比從高到低的順序為胸腺、鰓、肝臟、腸道、脾臟、頭腎、體腎、血液，其中，胸腺的CD4L-2+細胞含量極顯著地高于血液與體腎(p＜0.

6、01)，鰓、肝臟和腸道中CD4L-2+細胞含量顯著高于血液與體腎(p＜0.05)。用PHA刺激48h后，各免疫相關組織中CD4L-2+細胞比例發(fā)生了明顯變化，其中，頭腎、脾臟、肝臟與腸道中CD4L-2+細胞比例顯著升高，而胸腺中CD4L-2+細胞比例有所下降。激光共聚焦分析顯示，腸粘膜中嗜酸性細胞、嗜中性細胞、單核細胞、淋巴細胞等均為CD4L-2+細胞。
　　結論：本研究克隆了草魚CD4L-2基因，制備并鑒定了抗草魚CD4L-2單