1、研究背景 沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)是性傳播疾病的主要病原體之一，其感染在世界范圍傳播，每年以10％的速度遞增。由于約70—80％的女性和50％的男性為無(wú)癥狀感染，不及時(shí)診治或耐藥性的產(chǎn)生常常導(dǎo)致逆行感染，引起男性附睪炎、前列腺炎和女性盆腔炎、輸卵管炎、異位妊娠、不孕、早產(chǎn)、流產(chǎn)和死胎等；還可通過(guò)陰道或胎盤傳播給胎兒，引起新生兒沙眼衣原體結(jié)膜炎、肺炎以及其他并發(fā)癥，如Reiter綜合征等。近來(lái)又發(fā)現(xiàn)

2、其可引起活動(dòng)性關(guān)節(jié)炎，與動(dòng)脈硬化、冠心病也有關(guān)。 沙眼衣原體包括三個(gè)生物變種：沙眼生物變種，性病淋巴肉芽腫生物變種和鼠生物變種。根據(jù)主要外膜蛋白(major outer membrane protein，MOMP)的抗原表位及空間構(gòu)象差異，將人類沙眼衣原體分為15個(gè)血清型，其中L1、L2、L3引起性病淋巴肉芽腫，A、B、Ba、C型引起地方性沙H艮，而D—K型主要引起泌尿生殖道感染。隨后又發(fā)現(xiàn)3個(gè)新的亞型，Da、Ia和L2a。根據(jù)

3、MOMP可變區(qū)氨基酸的同源性將沙眼衣原體分為3個(gè)群，血清群B包括血清型B、Ba、D、Da、E、L1、L2和L2a；中間血清群包括血清型F和G；血清群C包括血清型A、C、H、I、Ia、J、K和L3。對(duì)沙眼衣原體進(jìn)行分型研究，將有助于監(jiān)測(cè)不同血清型的流行動(dòng)態(tài)，有助于臨床上判定持續(xù)性感染與再感染，指導(dǎo)臨床診治，有助于探討血清型與疾病過(guò)程或機(jī)體感染嚴(yán)重程度的相關(guān)性。 沙眼衣原體型和群的特異性由MOMP決定，是血清學(xué)分型的基礎(chǔ)。ompl基

4、因編碼MOMP，它的變異決定了MOMP的抗原表位，是基因分型的依據(jù)。ompl含5個(gè)穩(wěn)定序列區(qū)(CS)和相間隔的4個(gè)可變序列區(qū)(VS)，VSl～VS4分別編碼MOMP突出于膜外的4個(gè)易變蛋白區(qū)。Wang等于1974年創(chuàng)建了免疫血清學(xué)分型方法，成為沙眼衣原體分型的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而，由于細(xì)胞培養(yǎng)困難，儀器設(shè)備昂貴，無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的商品化試劑，限制了血清學(xué)方法的廣泛使用。國(guó)內(nèi)僅見(jiàn)1994年的應(yīng)用報(bào)道。直接ompl基因測(cè)序分型可精確地區(qū)別菌株間的差異，但其

5、缺點(diǎn)是不適宜鑒別混合感染、測(cè)序工作費(fèi)時(shí)、費(fèi)用昂貴。 基因芯片技術(shù)(microarray)是將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷希缓笈c標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。具有高通量、并行處理、微型化和易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，基因芯片技術(shù)在致病微生物研究中已得到廣泛應(yīng)用，如人類乳頭瘤病毒的分型、抗生素耐藥基因的檢測(cè)、產(chǎn)氣莢膜梭菌基因分型等。Ehricht等研究DNA芯片技術(shù)檢測(cè)衣原體敏感度證明了單一PC

6、R擴(kuò)增產(chǎn)物足以獲得特異的雜交結(jié)果。 方法 運(yùn)用DNAstar生物消息軟件包，對(duì)15個(gè)血清型沙眼衣原體的GerlBank信息和參考株的ompl基因序列進(jìn)行比對(duì)，分析沙眼衣原體ompl基因VSl、VS2、VS3和VS4片段序列的保守性和離散性。選取ompl基因的VS1-VS2片段作為靶序列，采用巢式PCR擴(kuò)增參考株和臨床株。直接測(cè)序法分析臨床株的VS1-VS2核苷酸序列和基因分型。用AuIl和DdeI限制性內(nèi)切酶消化VSl-

7、VS2序列，進(jìn)行臨床株RFLP分析和基因分型。DNAstar軟件設(shè)計(jì)寡核苷酸種、群和型特異性探針，用帶正電荷的尼龍膜作為載體，點(diǎn)探針制備寡核苷酸芯片，地高辛檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行顯色。寡核苷酸芯片法的優(yōu)化和評(píng)價(jià)：1)方法學(xué)優(yōu)化：滴定最佳探針濃度和選擇最佳雜交溫度。2)敏感性分析：用已知含量的衣原體培養(yǎng)物進(jìn)行定量分析；與常規(guī)質(zhì)粒FCR法比較直接檢測(cè)臨床標(biāo)本的敏感性。3)特異性分析：GenBank中Blast特異性分析；與參考菌株的雜交反應(yīng)；與泌尿生

8、殖道其它常見(jiàn)病原體雜交反應(yīng)；對(duì)芯片法檢測(cè)出的混合感染標(biāo)本進(jìn)行克隆測(cè)序鑒定；已知基因型菌株按不同比例混合后測(cè)序分析與芯片法檢測(cè)。 結(jié)果 1．15個(gè)沙眼衣原體血清型ompl基因系統(tǒng)發(fā)育樹顯示VSl、VS2和VS4均可將15個(gè)血清型分成3個(gè)基因群，且基因群與血清學(xué)分群結(jié)果完全相同，但VS3區(qū)片段短且離散性小，分群結(jié)果與血清學(xué)不同。型間的核苷酸序列離散率比較表明V$2和VSl離散性較強(qiáng)，VS4區(qū)最弱。 2．從保守

9、區(qū)CSl和CS3設(shè)計(jì)出2對(duì)通用引物，巢式PCR擴(kuò)增VS1-VS2片段，外引物擴(kuò)增長(zhǎng)度為約516bp和內(nèi)引物擴(kuò)增約453bp片段。 3．99株臨床株進(jìn)行ompl基因VS1-VS2序列分析，結(jié)果3例為雙峰圖而無(wú)法精確基因分型，89株臨床株與參考株的VS1-VS2顯示一致的核苷酸序列，7株存在堿基的突變或插入(突變率7.4％)，多為有意義突變，常見(jiàn)于D、E和F型，均發(fā)生于VSl區(qū)。96株菌株分成9個(gè)血清型，以F型29株(30.2％

10、)、E型22株(22.9％)、J型19株(19.8％)、D型12株(12.5％)和H型8株(8.3％)為主。 4. 60例臨床標(biāo)本進(jìn)行VS1-VS2 RFLP分析，結(jié)果分型率為98.3％(59／60)，基因分型共檢出7個(gè)血清型，其中以F、E、D和J型為主。 5. 設(shè)計(jì)并合成了1條種、3條群(B、C和中間群)和15條型(A—L3)特異性探針，制備出包括陽(yáng)性和陰性對(duì)照的沙眼衣原體檢測(cè)分型寡核苷酸芯片。 6.

11、 方法學(xué)評(píng)價(jià)：1)方法學(xué)優(yōu)化：結(jié)果顯示探針濃度為20pmol／μL和42℃雜交溫度是最適宜條件。2)敏感性分析：顯示寡核苷酸芯片法可檢測(cè)到4.7EB／ml水平；測(cè)定60例臨床ELISA陽(yáng)性標(biāo)本，與質(zhì)粒PCR法比較檢測(cè)符合率為98.2％。3)特異性分析：經(jīng)過(guò)GenBank中的BLAsT程序比較和雜交試驗(yàn)的優(yōu)化，除B和Ba型外，各探針均與相應(yīng)參考株顯示特異性反應(yīng)；與10種泌尿生殖道常見(jiàn)菌(陰道加特納桿菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球

12、菌、表皮葡萄球菌、白假絲酵母菌、單純皰疹病毒2型、人型支原體、溶脲脲原體和淋病奈瑟菌)進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果PCR擴(kuò)增均陰性，雜交陰性；芯片法檢測(cè)F／K型混合感染標(biāo)本l份經(jīng)克隆測(cè)序證實(shí)其正確性和特異性；已知B型和E型，F(xiàn)型和J型，D型和K型菌株DNA定量后分別按照1∶1、1∶3和1∶5的比例混合后，芯片法檢測(cè)結(jié)果一致，而測(cè)序法檢測(cè)1∶3和1∶5混合時(shí)均為單一型。4)與測(cè)序法分型比較：隨機(jī)測(cè)定30例臨床標(biāo)本，結(jié)果芯片法與測(cè)序法的符合率90.6

13、％(28／30)。2例不符合標(biāo)本，芯片法測(cè)定為混合感染(D／F，F(xiàn)／K)，而測(cè)序法1例為F基因型，1例測(cè)序雙峰。 7. 應(yīng)用寡核苷酸芯片研究不同人群中沙眼衣原體流行基因型。共計(jì)166株沙眼衣原體感染標(biāo)本中，通過(guò)基因分型共檢出182株菌，包括9個(gè)基因型，總體優(yōu)勢(shì)流行型為E型(27.5％)、F型(22.0％)、D型(14.3％)、J型(15.0％)和H型(8.8％)。113例病門診病人中檢出119株菌，以F(26.9％)、E(2

14、4.3％)、J(16.8％)、D(13.4％)和H(8.4％)型為主，混合型感染率5.3％(6／113)而53例女性性工作者標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)混合感染8例(15.1％，8／53)，基因型以E(33.3％)、D(15.9％)、F(15.9％)和K(12.7％)型為主。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示F型在門診病人中的流行率顯著高于女性性工作者人群(X<'2>=4.8，P<0.05)，而混合型感染率和K型流行率在女性性工作者人群顯著高于門診病人(X<'2>：4.5

15、，P<0.05; 8． 沙眼衣原體基因型與男性尿道感染臨床癥狀的相關(guān)性研究：94例男性尿道感染沙眼衣原體株基因分型檢出9種基因型，主要流行型別是F(28.7％)，E(26.6％)，J(19.1％)和D(10.6％)。無(wú)癥狀的感染率為27.7％，其中F和E型為主(65.4％)。剔除2例伴有淋球菌感染病例后，分析各基因型/群與臨床癥狀的相關(guān)性，結(jié)果顯示均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但可見(jiàn)F和J型引起較重的炎癥反應(yīng)。 結(jié)論

16、 1．沙眼衣原體ompl基因的4個(gè)VS序列分析及實(shí)驗(yàn)用參考菌株的測(cè)序分析，證明了VSl和VS2具有群和型別間最大的離散性，可作為沙眼衣原體基因分群和分型的靶基因，為研制沙眼衣原體寡核苷酸芯片檢測(cè)分型技術(shù)提供了參考依據(jù)。 2．臨床流行株ompl基因的VSl-VS2序列中堿基突變的發(fā)生率為7.4％，多為有意義突變，常見(jiàn)于D、E和F型，且突變位置均為VSl區(qū)的5’端。探明了基于VSl-VS2序列設(shè)計(jì)探針的可能性和設(shè)計(jì)部位。RFL

17、P分析結(jié)果進(jìn)一步表明了VSl VS2序列的離散性足以進(jìn)行沙眼衣原體基因型鑒別。 3．本研究建立的寡核苷酸芯片技術(shù)，可以從種、群和型的水平直接檢測(cè)臨床標(biāo)本中沙眼衣原體。芯片法敏感性與臨床常規(guī)質(zhì)粒PCR相符，最低檢測(cè)濃度達(dá)4.7 EB/mL。特異性分析證明除B和Ba型外，探針與參考菌株呈特異性雜交，與泌尿生殖道其它常見(jiàn)菌無(wú)交叉反應(yīng)。芯片法可直接鑒別臨床混合型感染。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便、快速，可在一般分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，適用于大規(guī)模的分子

18、流行病學(xué)研究。 4．廣東部分地區(qū)沙眼衣原體流行基因型與其它地區(qū)存在差異，不同人群中流行型別不同，女性性工作者混合型感染的比例較高，是沙眼衣原體傳播的重要傳染源。不同血清型沙眼衣原體與男性尿道感染的臨床癥狀間無(wú)明顯的相關(guān)性。 5．本研究建立了沙眼衣原體常見(jiàn)基因型寡核苷酸芯片技術(shù)，其分辨率尚不能鑒別亞型。今后，隨著基因突變，新的型或亞型逐漸增加，耐藥基因的產(chǎn)生，將進(jìn)一步研究包括種、群、型和亞型，以及耐藥基因的高密度寡核苷酸芯