1、本課題主要就restin的功能和轉錄調控兩方面作進一步探討，進而為認識restin生理功能以及與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系提供有價值的信息。 首先在早幼粒細胞性白血病HL-60細胞系中用ATRA誘導restin表達，RT-PCR方法檢測其表達水平與誘導時間之間的關系；在該過程中同時檢測細胞生物學功能的改變。研究發(fā)現早幼粒細胞性白血病HL-60細胞經ATRA誘導1天后即可檢測到restin的表達，且表達水平不隨藥物作用時間點的繼續(xù)延長而發(fā)

2、生明顯變化；在restin表達第2天時即出現G0/G1期阻滯，并隨著表達的持續(xù)而阻滯愈來愈明顯；同時細胞出現較明顯的向中幼粒、晚幼粒細胞分化的特征，并也隨著表達的持續(xù)分化而特征愈加明顯。這種時間的一致性提示restin與抑制細胞周期、促進細胞分化密切相關，從而建立restin與細胞分化等的相關性。 在簡單了解restin的基本生物學功能的基礎上，明確它的轉錄調控機制，闡明它在維甲酸信號通路中的位置和所發(fā)揮的作用有助于建立其與腫瘤

3、等疾病的發(fā)生發(fā)展以及防治的聯系。為此，分析并克隆了restin基因翻譯起始位點ATG上游約2.1Kb序列并構建熒光報告系統(tǒng)，通過檢測報告基因的表達證明此片段具有啟動子活性。對該段序列用啟動子分析軟件進行分析，預測有3個可能的核心啟動子區(qū)，存在3個STAT1、1個C/EBP和1個P53轉錄因子的結合位點。根據這些位點的不同位置對此序列依次進行截短，構建熒光報告質粒RP2(1520bp)、RP3(1417bp)、RP4(945bp)、RP5

4、(800bp)、RP6(333bp)，分別瞬時轉染真核細胞，檢測經ATRA刺激前后報告基因熒光素酶的表達變化，結果顯示RP2-RP5均接受ATRA的調控，且調控強弱不同，說明有多個順式作用元件參與調控。而截去最后一個預測的轉錄因子STAT1結合位點GAS元件的RP6則不再接受ATRA的調控，因此推測鄰近ATG的GAS元件可能為調控restin轉錄的一個重要順式作用元件，STAT1可能通過此元件參與調控過程。此外，將RP1的3’端(即AT

5、G上游)333bp截去后重新構建的RP7則失去啟動子活性，說明此區(qū)域包含了核心啟動子。但因為-273bp至-1是restin的5’UTR，因此-333bp至-273bp即為核心啟動子。為確立STAT1在ATRA誘導restin表達中的作用，我們分別在STAT1可誘導表達的MCF-7和STAT1不可誘導表達的MDA-MB-231兩種乳腺癌細胞系中探討了restin的表達調控。MCF-7和MDA-MB-231細胞在相同條件下經ATRA刺激2

6、4小時后，RT-PCR方法檢測restinmRNA水平變化。結果顯示在MCF-7細胞中經ATRA刺激后可檢測到restin的表達；但在MDA-MB-231細胞中，ATRA刺激前后均無法檢測到restin的表達。將構建好的只含有一個GAS元件的RP5分別轉染這兩種細胞系，結果顯示RP5僅在MCF-7細胞系中接受ATRA的調控。但當MDA-MB-231中有外源表達的STAT1時RP5則接受ATRA的調控，且加入IFN-γ后有增強作用。這些結

7、果表明，轉錄因子STAT1確實參與了ATRA對restin基因表達調控的過程。 綜上所述，本課題在研究restin的基本生物學功能時發(fā)現它與細胞周期、細胞分化密切相關；為明確其轉錄調控機制以確立其與正常生理功能以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展的關系，構建了它的不同長度的啟動子熒光報告系統(tǒng)，通過檢測報告基因的表達變化而定位了核心啟動子區(qū)，并發(fā)現了參與調控的順式作用元件和可能與此元件相作用的轉錄因子STAT1確實參與了ATRA誘導restin基因