1、家蠶（Bombyx mori）是鱗翅目重要的模式昆蟲，其一生要經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹、成蟲四個(gè)發(fā)育過程，蛋白質(zhì)在這些生命過程中執(zhí)行著不同的功能。而蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮要經(jīng)過一系列的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，如甲基化、乙?；?、磷酸化和泛素化修飾等。其中泛素化修飾是泛素蛋白 G76甘氨酸識(shí)別并結(jié)合底物賴氨酸殘基位點(diǎn)，一方面介導(dǎo)蛋白進(jìn)入26S蛋白酶體復(fù)合物，使底物蛋白發(fā)生降解，另一方面也可能與底物蛋白結(jié)合發(fā)揮非降解作用，參與其它生物學(xué)過程。同時(shí)泛素蛋白也可以形

2、成多聚泛素鏈，被磷酸化、乙?；刃揎?。隨著對(duì)泛素化修飾研究的逐步深入，在生物體內(nèi)又發(fā)現(xiàn)一類在結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系上與泛素都極為相似的類泛素蛋白家族，如SUMO、NEDD8等。它們?cè)诠δ苌吓c泛素有較大的差異，同時(shí)也可以修飾泛素蛋白鏈。研究發(fā)現(xiàn)，類泛素化修飾不僅可以調(diào)控泛素化修飾，間接發(fā)揮降解靶蛋白作用，而且還具有免疫調(diào)節(jié)、DNA損傷修復(fù)、亞細(xì)胞定位和細(xì)胞周期調(diào)控等功能。NEDD8是一類目前發(fā)現(xiàn)的與泛素序列相似度最高的類泛素蛋白，蛋白序列高度保守

3、。目前越來越多的證據(jù)表明NEDDylation修飾在參與細(xì)胞周期調(diào)控方面的作用是必需的。家蠶有關(guān) NEDDylation修飾的研究還鮮有報(bào)道，通過本研究我們希望闡釋NEDDylation修飾在家蠶細(xì)胞周期調(diào)控方面的作用，以及鑒定家蠶中發(fā)生NEDDylation修飾的底物蛋白，同時(shí)泛素蛋白和類泛素蛋白與底物的修飾位點(diǎn)都是賴氨酸殘基位點(diǎn)，而且多聚泛素鏈可以受到類泛素化修飾，類泛素鏈也可以受到泛素化修飾，幾種修飾之間可能存在競爭與協(xié)同關(guān)系。<

4、br>　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴家蠶BmNedd8基因編碼77個(gè)氨基酸殘基，蛋白序列高度保守，第76位有保守的二甘氨酸激活位點(diǎn)。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)家蠶 BmNedd8與黑脈金斑蝶聚為一支，與物種間進(jìn)化較為一致。鑒定并克隆了家蠶NEDDylation修飾酶基因，胚胎發(fā)育時(shí)期表達(dá)特征分析顯示修飾基因在各時(shí)期均持續(xù)表達(dá)，5齡3天各組織表達(dá)特征顯示修飾基因在各組織表達(dá)無特異性。BmNedd8在有絲分裂間期主要定位在細(xì)胞核，隨著分裂期的進(jìn)行，逐漸定位

5、到細(xì)胞質(zhì)和紡錘體，分裂末期，又定位到染色體。其定位與有絲分裂染色體的分布密切相關(guān)，暗示家蠶NEDDylation修飾可能參與調(diào)控細(xì)胞周期。⑵通過合成參與NEDDylation修飾基因的雙鏈RNA，干涉處理BmN4-SID I細(xì)胞，在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上均可以檢測到明顯的干涉效果。干涉處理家蠶細(xì)胞NEDDylation修飾基因，導(dǎo)致細(xì)胞周期分布出現(xiàn)G2/M期滯留現(xiàn)象，表明NEDDylation修飾可以調(diào)控細(xì)胞周期。同時(shí)干涉掉修飾基因的細(xì)胞

6、導(dǎo)致有絲分裂中期染色體的排布發(fā)生紊亂，無法定向排列于赤道板，紡錘體無法與染色體結(jié)合將其拉向細(xì)胞兩極從而導(dǎo)致細(xì)胞停留在分裂期，引起G2/M期細(xì)胞數(shù)增多，表明NEDDylation修飾可以通過影響染色體的排布進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程。⑶通過構(gòu)建融合FLAG標(biāo)簽蛋白的BmNedd8野生型與BmNedd8羧基端GG識(shí)別位點(diǎn)缺失型和GG→AA突變型轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，免疫沉淀富集底物蛋白和LC-MS/MS鑒定，一共鑒定到了58個(gè)發(fā)生特異修飾的底物蛋白。其中

7、31%為已報(bào)道的與核糖體形成相關(guān)蛋白。此外，還有豐度較高的與有絲分裂紡錘體微管形成相關(guān)蛋白：肌動(dòng)蛋白、β-Tubulin蛋白等，與代謝相關(guān)的ATP合成酶等，與SUMOylation修飾相關(guān)的SUMO E3連接酶RanBP2，表明家蠶細(xì)胞可能通過對(duì)這些底物蛋白的修飾從而參與調(diào)控細(xì)胞周期和基礎(chǔ)代謝進(jìn)程。底物蛋白修飾位點(diǎn)附近氨基酸較為靈活，無保守基序。GO功能分析顯示多數(shù)蛋白參與色素沉著和代謝進(jìn)程，部分蛋白也參與到胞內(nèi)組分的定位、免疫調(diào)節(jié)、核